废水处理功能菌株FA-2的实时荧光定量PCR检测

FA-2是油脂化工废水处理系统中分离到的降解脂肪酸和脂肪胺的功能菌.本研究以大肠杆菌为参照菌,基于荧光定量PCR技术,建立了检测FA-2相对含量的荧光定量PCR方法.根据FA-2已知特异序列GENE2和大肠杆菌16 s rRNA基因序列GENE1分别设计合成特异引物和Tagman探针,采用实时荧光定量PCR技术分别检测各样本FA-2和E.coli 16 s rRNA基因的相对拷贝数,获得了FA-2及大肠杆菌的标准曲线.并比较这两种基因剂量之比例和混和的菌数比例之间的关系.结果表明混合菌液中FA-2的含量与CtGENE2与CtGENE1的差值ΔCt呈线性关系,由此可以推算出模板DNA的数量及对应的细菌数量.荧光定量检测结果与直接计数结果基本一致.该方法的建立,为进一步在废水处理系统中应用FQ-CR检测功能菌的含量打下基础.     

双链置换探针实时PCR用于DNA池的等位基因频率测定

结合荧光双链置换探针的特异性和实时PCR的准确定量能力,建立了一种新颖、准确、价廉且高通量的测定DNA池等位基因频率的方法.该方法采用不同荧光标记的双链置换探针1次PCR反应即可测定出等位基因频率.实验以β 地中海贫血CDs41 42( TCTT)突变为对象,分别用荧光染料FAM和ROX标记野生型和突变型探针,由实时PCR检测建立的等位基因浓度与循环阈值的响应曲线计算DNA池的等位基因频率.结果表明,建立的系列等位基因浓度与循环阈值呈线性关系,线性相关系数分别为0.9977(野生型等位基因)和0.9938(突变型等位基因),可检测的最低等位基因频率达1%,等位基因频率在1%～90%范围内测定误差小于4%.该方法可广泛用于流行病学调查、遗传连锁分析以及全基因组连锁不平衡扫描等领域.     

厦门市区10月份大气气溶胶中细菌群落结构的初步研究

为了全面准确地研究厦门大气气溶胶的细菌群落构成,使用不依赖于培养的分子生态学手段对厦门市区10月份大气气溶胶中的细菌群落结构多样性进行了分析.通过气溶胶采样器在10月份3次收集了气溶胶样品,利用膜DNA提取试剂盒能够较有效地提取到气溶胶中的环境DNA,并且所提取的DNA能够用于后续的PCR扩增及细菌16S rRNA基因克隆文库的构建.克隆文库中的100个克隆子分别分布在3个细菌类群中,分别是:壁厚菌门(Firmicutes),β及γ变形细菌门(Proteobacteria).其中厚壁菌门的克隆子占71%,β变形细菌门占28%,γ变形细菌门占1%.细菌气溶胶的优势菌为Solibacillus属、微小杆菌属(Exiguobacterium)、罗尔斯顿菌属(Ralstonia).在所构建的克隆文库中,发现有部分的克隆子的序列与致病菌或机会致病菌的16S rRNA基因的序列相似,包括引起医院血液感染的细菌不动杆菌属(Acinetobacter)和皮氏罗尔斯顿菌(Ralstonia pickettii),坏疽性口炎及口腔溃疡病原菌(Caryophanon sp.)等.为长期全面监测厦门市微生物气溶胶的组成与变化以及评估空气中微生物对人类健康的潜在影响提供了重要信息.     

兔泰泽病原体实时荧光PCR检测方法的建立

目的 建立一种适用于兔泰泽病原体检测的实时荧光PCR检测方法。方法 根据泰泽病原体的16S rRNA序列设计了特异性的引物和探针,对引物和探针浓度进行了优化,并评价其敏感性、特异性和重复性。同时,使用该方法对临床样品进行了检测,并与已报道的套式PCR方法进行比较。结果 建立了能够特异检测泰泽病原体的实时荧光PCR检测方法,该方法检测质粒标准品的最低检测限为8 copies/μL,不与SPF级实验动物必须排除的多种细菌发生交叉反应,批内和批间重复变异系数均小于3%,重复性良好。对70份临床样品的检测结果显示该方法的阳性样品检出率高于套式PCR检测方法。结论 建立的实时荧光PCR方法特异性好、灵敏度高、重复性好,适用于兔粪球样本中泰泽病原体的检测。     

从业人员预防性健康体检沙门/志贺氏菌检验PCR方法快速筛查的应用

采用实时荧光定量PCR方法快速检测食品等从业人员肠道致病菌,并与培养法进行比较,了解实时荧光定量PCR方法的应用价值.方法:随机采集96 752份从业人员肛拭子标本分别进行实时荧光定量PCR方法和培养法检测沙门氏菌和志贺氏菌,比较两种方法对两种肠道菌的检出率.结果:96 752份标本中,实时荧光定量PCR方法共检测出91份标本沙门氏菌阳性,其中83份分离阳性,41份志贺氏菌阳性,其中30份分离阳性.而传统培养法检测未检出.结论:实时荧光定量PCR方法可以很好的应用在从业人员肠道致病菌的筛查,并且可以提高从业人员肠道致病菌的检出率和准确性,节省劳动力,降低工作人员的工作强度.     

大黄鱼小黄鱼实时荧光PCR鉴定

目的:建立一种快速、准确的大黄鱼小黄鱼实时荧光PCR鉴定方法.方法:根据GenBank中大黄鱼、小黄鱼线粒体中ND6基因的序列,设计并合成特异性引物和cycling探针,以草鱼为阴性对照,进行实时荧光PCR反应.结果:利用设计合成的大黄鱼和小黄鱼特异性引物和cycling探针进行实时荧光PCR反应,大黄鱼和小黄鱼均产生特异扩增曲线,对照的草鱼没有产生扩增曲线.结论:利用设计的引物和cycling探针,可准确快速鉴定大黄鱼和小黄鱼.     

16S rRNA测序在细菌鉴定中的应用

对分离获得的一株细菌P29,经聚合酶链式反应扩增后测定该菌株的16S rRNA基因序列,由16S rRNA基因序列比较可知,菌株P29与肠杆菌属和泛菌属亲缘关系最为接近,16S rRNA基因相似性达到99%.结合生理生化实验结果综合分析后,将其鉴定为泛菌属的成团泛菌.     

产氢菌的16S -23S rDNA间隔区的长度变异性分析

生物制氢细菌Rennanqilyf3的16S rRNA gene(rDNA)-23S rDNA间隔区碱基序列被测定，利用PCR扩增间隔区DNA，间隔区碱基序列存在长度多态现象．用这一长度多态现象进行产氢发酵细菌的辨认和识别，产氢发酵细菌Rennanqilyf3的16S rRNA gene(rDNA)-23S rDNA间隔区的PCR产品从1270到398bp，共有5个序列，碱基数目分别为1270、398、638、437和436bp。     

16S rRNA序列分析在多杀巴斯德氏菌鉴定中的应用

目的应用16s rRNA序列分析方法,对多杀巴斯德氏菌进行鉴定。方法采集猝死家兔样本,进行病理组织学检查和病原菌分离培养。针对细菌16S rRNA基因保守区序列设计一对引物,以分离菌株抽提的DNA为模板,进行PCR扩增及16S rRNA序列分析。结果从死亡家兔肺脏中分离鉴定出了一株多杀巴斯德氏菌(PMr0901)。将分离菌株序列与GenBank中收录的序列进行比较,BLAST分析结果显示PMr0901与多杀巴斯德氏菌参考菌株PM70的16S rRNA核苷酸同源性大于99%。分离菌株对阿莫西林/克拉维酸、头孢曲松、左氧沙星、四环素敏感,而对青霉素G已产生耐药性。结论16s rRNA序列分析的分子生物学方法可用于病原菌的鉴定。     

同时检测小鼠微小病毒(MVM)和小鼠细小病毒(MPV)的荧光定量PCR的建立及应用

目的 建立同时检测小鼠微小病毒(MVM)和小鼠细小病毒(MPV)的荧光定量PCR方法,并进行初步应用。方法 比对NCBI上发表的MVM和MPV基因组序列,设计1对引物和探针,可同时检测MVM和MPV。考察MVM-MPV引物探针的特异性和灵敏度,并对178份清洁级小鼠粪便DNA样本进行检测。结果 MVM-MPV荧光定量PCR方法最佳线性范围为109～104拷贝/μL,标准曲线的线性关系良好,R2值可达0.99,灵敏度为101拷贝/μL,特异性强。应用MVM-MPV探针对178份小鼠粪便DNA检测,结果为2份阳性样本,经MVM、MPV特异性探针鉴定,2份阳性样本均为MPV感染。阳性样本经全基因组测序后与NCBI网站上MPV(NC_001630.1)序列比对,一致率为96%。结论 建立的MVM-MPV荧光定量PCR方法,能够有效快速地同时检出小鼠细小病毒和小鼠微小病毒。     

杂色鲍肠道益生菌的分离和鉴定

从杂色鲍(Haliotis diversicolor)肠道内,共分离出84株细菌,经16S rRNA基因序列比对,共产生了35种类型(OTU),分属于17个属,利用纸片扩散法进行了细菌消化酶活性及抑菌活性检测.有75株菌在不同程度上表现出淀粉酶活性、蛋白酶活性、脂肪酶活性、琼胶酶活性、纤维素酶活性或褐藻酸钠酶活性;有24株菌不同程度地抑制2～8株致病菌的生长.结合实验结果,对9株潜在益生菌进行溶血实验检测及动物安全性实验.其中AP12和AP34不产生溶血素,并且在菌株浓度108 CFU/g时对鲍无明显的毒害作用,表明此2株细菌可以作为潜在的益生菌应用于杂色鲍的养殖.AP34具有5种消化酶活性,与fu同温层芽孢杆菌(Bacillus stratosphericus)16S rRNA基因序列同源性最高,为99.87％;AP12对8株致病菌均表现出较强的抑菌活性,该菌16S rRNA基因序列与济州岛褐色杆菌(Phaeobacterdaeponensis)相似性最高,为98.63％.     

应用FQ-PCR检测孕妇外周血中胎儿细胞含量

合成一对染色体单拷贝基因GAPDH特异的引物和一对Y染色体单拷贝基因SRY特异的引物,并合成两条特异性TaqMan探针,加等量的DNA到含有上述两个引物探针的PCR反应体系中,行荧光定量PCR,获得两种基因的定量值,通过这两种基因含量的比值,计算孕妇外周血中胎儿细胞含量.在30 μL FQ-PCR反应体系中,加入最少约0.05 ng 正常男性基因组DNA能够稳定地获得扩增曲线;在60例临床孕妇外周血标本DNA 的DCFQPCR扩增中有35例出现SRY扩增阳性,阳性率为58.3%;在这些标本中,GAPDH 基因Ct值范围在20~22之间;SRY 基因Ct值范围在33~40;经计算,胎儿细胞含量范围在1/10.4~1/10.6.     

志贺氏菌实时荧光单引物等温扩增方法的建立及应用

以志贺氏菌ipaH基因特异序列为靶序列,设计RNA-DNA组合引物和链终止序列,优化反应体系,建立实时荧光单引物等温扩增检测志贺氏菌的方法,反应时间为44min。通过对4株不同群志贺氏菌和12株其他食源性致病菌进行实时荧光单引物等温扩增检测,结果表明,除4株志贺氏菌外,其他细菌均未扩增出荧光曲线。进一步研究表明,采用普通热裂解法提取DNA,实时荧光检测福氏志贺氏菌DNA的灵敏度为1.16fg/μL,纯培养菌液的灵敏度为1.3CFU/mL;对牛奶模拟样品中福氏志贺氏菌的检出限是1.8CFU/mL。研究结果表明,实时荧光单引物等温扩增检测志贺氏菌灵敏度高、特异性强、耗时短、方法简便。     

四川黑熊线粒体12S和16S rRNA基因的克隆及序列分析

利用哺乳动物线粒体基因的保守序列设计引物,采用PCR方法,首次从亚洲黑熊四川亚种（Ursus thibetanus mupinensis）的肌肉组织总DNA中扩增出了线粒体12S rRNA和16S rRNA基因并进行了序列测定及分析.结果表明,四川黑熊12S rRNA基因长965 bp;16S rRNA基因长1 580 bp.通过进一步的序列分析表明,四川黑熊的12S rRNA和16S rRNA基因有较高的进化速率,与美洲黑熊、棕熊、北极熊、眼镜熊及大熊猫的相应基因相比较有较大差异,其中与美洲黑熊的同源性相对较高.     

实时荧光定量PCR法检测环境假单胞菌属细菌丰度

应用实时荧光定量PCR法,建立了总细菌及假单胞菌属的标准曲线,并以环境样本中假单胞菌属与总细菌的比值反映其细菌丰度.应用该方法评价人工除藻反应器中组合填料、无纺布、弹性填料等介质对太湖水中溶藻细菌之一的假单胞菌属的富集情况.结果显示:该方法对总细菌的检测范围为103~108个基因拷贝/μL(R2=0.997);假单胞菌属的检测范围为1~105个基因拷贝/μL(R2=0.994).对除藻反应器溶藻细菌富集效果的评价显示,所建立的方法能有效检测反应器中填料对该类溶藻细菌的富集程度.初步证明所建立的方法可有效定量假单胞菌属在环境样本中的丰度.     

小鼠微小病毒( MVM) 荧光定量PCR 检测方法的建立及初步应用

摘要: 目的建立小鼠微小病毒( MVM) 荧光定量PCR 方法,并初步应用于实验小鼠中。方法根据NCBI 上发表的MVM( NC_001510) 基因组序列,设计引物和探针,建立MVM 荧光定量PCR 方法。考察引物探针的最佳线形范围,特异性及灵敏度,并使用该方法对178 份清洁级小鼠粪便DNA 样本进行检测。结果MVM 荧光定量PCR 方法最佳线性范围为109 ～ 104 拷贝/μL,标准曲线的线性关系良好,R2 值可达0. 99,灵敏度为101 拷贝/μL,特异性强,与大鼠细小病毒H-1 株和KRV 株、猪细小病毒均无交叉反应。应用荧光定量PCR 方法对178 份小鼠粪便DNA进行检测,结果均为阴性。结论建立的MVM 荧光定量PCR 方法具有特异、灵敏的特点,为MVM 的流行病学调查、检测提供了有效的技术支持。     

荧光定量PCR技术及其在动物病毒病定量检测中的应用

荧光定量PCR技术是一种核酸定量技术,该技术在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程,最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法.该技术具有特异性强、灵敏度高、重复性好、定量准确、速度快、全封闭反应等特点,因此在动物病毒病的检测中,荧光定量PCR技术不但能定量检测病原体感染的强弱和在机体内的分布,还具有灵敏、快速、省力的特点.     

牛疱疹病毒Ⅰ型(BHV-1)荧光定量PCR检测方法的建立及应用

目的 建立牛疱疹病毒Ⅰ型(BHV-1)实时荧光定量PCR检测方法,用于牛源性样本中BHV-1的快速检测。方法 根据已发表的BHV-1 gB基因设计特异引物和TaqMan探针,建立BHV-1实时荧光定量PCR方法。并对方法的特异性、敏感性、重复性稳定性等进行测定。用建立的方法对181份牛源性样本进行检测。结果 建立的BHV-1荧光定量PCR检测方法与牛副流感病毒Ⅲ型(BPIV3)、牛病毒性腹泻病毒1型(BVDV1)、猪伪狂犬病毒(PRV)、单纯疱疹病毒Ⅰ型(HSV-1)、猫疱疹病毒1型(FHV-1)均无交叉反应;检测灵敏度可达到1×101copies/μL;批内变异系数均小于5%。应用建立的方法检测181份牛源性样本,有6份样本BHV-1核酸为阳性。结论 建立的BHV-1荧光定量PCR检测方法具有快速、特异、敏感及稳定的特点,可用于牛源性样本中BHV-1污染的检测。     

一株海洋新鞘氨醇杆菌phe-8(Novosphingobium sp.)的PAHs降解基因和降解特性

以菲为唯一碳源和能源从厦门近海海水样品中筛选到一株能够降解多种PAHs的细菌.16S rDNA序列同源性分析表明它可能属于新鞘氨醇杆菌属(Novosphingobium sp.).根据已经报道的PAHs起始双加氧酶大亚基基因序列,设计了一对简并引物,并PCR扩增得到了约700 bp的基因片段.比对结果显示它同已报导的一株降解菌Novosphingobium aromaticivorans F199质粒上的bphA1f基因相似度最高,达到98.26%,该基因编码的蛋白推断是萘或联苯双加氧酶大亚基.以PCR产物为模板制备DNA探针, Southern杂交表明:该基因位于其质粒DNA上.采用气相色谱-质谱联用测定了该菌的降解率,发现它可以高效降解多种高分子量PAHs.     

基于荧光定量PCR的土壤总DNA提取次数研究

探究在不借助其它仪器设备和试剂的条件下,土壤总DNA提取的优化方案。结合荧光定量PCR技术和高通量测序技术对土壤总DNA的提取次数进行研究;发现3次提取的DNA样品的核酸累计量和16S rRNA基因的拷贝数分别占总量的94.84%、85.37%,前4次提取的DNA样品的测序分析结果显示各样品中细菌的相对丰度差异不显著。因此,建议绝对定量分析的实验进行2次以上的DNA提取,定性分析和相对定量分析实验则只需1次提取即可。