环糊精水解酶cds1-3底物通道氨基酸的定点突变研究

本研究对具有大分子水解能力的环糊精水解酶cds1-3的蛋白结构进行分析,选取底物通道相关氨基酸进行定点突变。通过比较突变酶和野生酶的功能差异,定位决定cds1-3特殊功能的氨基酸。采用sybyl 1.2进行蛋白质底物结合分析,选取和多聚体形成、底物结合以及底物通道相关的氨基酸Glu66、Pro48、Phe289为突变位点,反向PCR构建pSE380/E66G、pSE380/P48H、pSE380/F289A表达质粒并进行表达,获得酶活突变体并与原始酶进行底物特异性比较分析。其结果显示,突变酶E66G降解大分子底物木薯淀粉和支链淀粉的相对酶活力分别提高26.96%和23.15%,而对小分子底物普鲁兰糖的水解能力下降13.14%。因此,cds1-3是一个能水解大分子底物的特殊环糊精水解酶,氨基酸Glu66是cds1-3水解大分子支链淀粉的关键氨基酸之一。     

环糊精水解酶底物运输通道的动态结构分析

【目的】环糊精水解酶是作用于特殊底物的水解酶,可以水解圆锥形结构的底物。分析这个酶的底物通道为水解特殊结构底物提供研究基础。【方法】利用分子动力学模拟环糊精水解酶存在的底物通道,比较环糊精水解酶BsCMD_1J0H和TspCMD_1SMA在底物运输通道上的差异。【结果】BsCMD_1J0H和TspCMD_1SMA都为糖基水解酶家族13的蛋白质,它们的碳骨架基本吻合,而在α?螺旋分布上,TspCMD_1SMA相比于BsCMD_1J0H来说,螺旋结构更趋向于在蛋白质中心聚集。BsCMD_1J0H有6条底物通道连通蛋白质表面和活性中心,TspCMD_1SMA有8条底物通道连通。BsCMD_1J0H的底物通道平均半径为1,TspCMD_1SMA的底物通道平均半径为1.2。【结论】本研究提供了BsCMD_1J0H和TspCMD_1SMA两个蛋白质在和底物接触中的相关底物通道信息。     

新型Ⅰ型普鲁兰酶基因的克隆表达及酶学性质

【目的】筛选并克隆表达高酶活且具有一定热稳定性的新型普鲁兰酶。【方法】克隆Tumebacillus flagellatus GST4的普鲁兰酶基因pulB,构建重组质粒后转化宿主菌大肠杆菌进行诱导表达,再运用亲和层析进行纯化并分析其酶学性质和结构。【结果】pulB在大肠杆菌中实现可溶性表达,发酵液上清酶活力达到78U/mL,粗酶液经纯化后比活力为258U/mg。重组酶PulB最适反应温度和pH值分别为55℃和5.0,在较窄的酸性范围内(pH值4.5~5.5)酶活力比较稳定;对普鲁兰糖的Km=(16.28±0.03)mg/mL,Vmax=(22.05±0.02)μmol·min-1·mg-1。PulB的DNA序列与GenBank数据库里的任何序列都没有同源性,在蛋白质序列上,由基因pulB编码的氨基酸序列与T.aegyptius的环麦芽糖糊精酶相似性最高,BlastX比对的Identities为54%,Positives为69%,SMART结构预测分析发现,pulB具有淀粉酶的结构域。底物特异性分析表明,它可水解普鲁兰糖和支链淀粉生成线性的低聚糖或麦芽三糖。【结论】重组酶PulB是尚未报道的新型普鲁兰酶,它可水解普鲁兰糖和支链淀粉,属Ⅰ型普鲁兰酶。     

重组草酸青霉生淀粉糖化酶的酶学特性鉴定

【目的】了解在毕赤酵母中表达的来源于草酸青霉(Penicillium oxalicum)GXU20的重组生淀粉糖化酶的酶学特性。【方法】用3,5-二硝基水杨酸法测定pH值、温度、金属离子和化学试剂对纯化的重组生淀粉糖化酶的活力的影响,同时测定酶的底物特异性、酶对生淀粉的吸附能力以及酶对不同生淀粉的水解效率等,用高效液相色谱法对该酶水解生木薯淀粉的产物进行分析鉴定,用扫描电子显微镜观察重组酶对不同生淀粉颗粒的水解方式。【结果】重组生淀粉糖化酶rPoGA15A的最适pH值为4.5,最适温度为65℃,在pH值为2.0~10.0时,重组酶具有较好的pH耐受性,温度小于50℃时,酶的稳定性好。除Ag~+、Cu~(2+)和SDS之外,其他大部分金属离子和化学试剂对重组酶的酶活力影响不大。重组生淀粉糖化酶对大米和玉米生淀粉的活性较高,对木薯和马铃薯生淀粉的活性次之,重组生淀粉糖化酶rPoGA15A对不同生淀粉的吸附能力与其对相应不同生淀粉的水解活性大小呈正相关。扫描电子显微镜观察表明重组生淀粉糖化酶对不同生淀粉颗粒的降解作用明显,水解方式各有特点。高效液相色谱分析表明该重组生淀粉糖化酶水解生木薯淀粉的产物仅有葡萄糖。重组生淀粉糖化酶rPoGA15A在40℃下对大米和玉米生淀粉水解72h后水解率分别达到86.5%和71.9%。【结论】重组生淀粉糖化酶具有广泛的pH耐受性,对生淀粉具有高水解活性,在生淀粉的水解和生料同步糖化发酵生产酒精中有一定的应用潜力。     

酶法制备粉状木薯淀粉胶黏剂反应条件的研究

【目的】研究利用α-淀粉酶对木薯淀粉进行降解制作粉状木薯淀粉胶黏剂的方法。【方法】通过单因素和正交实验确定酶水解木薯淀粉的最佳工艺条件。【结果】酶水解木薯淀粉的最佳工艺条件为:A2C3B2,即酶用量为1.0%,酶解温度为45℃,酶解时间为15min。按此条件所得的成品木薯淀粉胶的粘合强度为13.9038N·cm-2,粘度为1.0477Pa·S,不添加其他物质,粘合强度强,流动性非常好。【结论】该方法具有低成本,无污染和高效的特点。     

阴沟肠杆菌一个内切纤维素酶Cel8A的克隆和功能证实

【目的】为了解决纤维素的酶水解问题,分析能水解纤维素的微生物的相关基因。【方法】从阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)的基因组数据中挖掘纤维素酶相关基因,发现开放读码框Cel8A和纤维素酶基因序列具有高相似性。利用重组表达技术在大肠杆菌中对Cel8A基因进行表达,纯化重组蛋白质并对该蛋白质进行功能鉴定。【结果】Cel8A蛋白质能水解羧甲基纤维素钠,它具有β-1,4-内切葡聚糖酶的水解特性。Cel8A的最适反应pH值为7.0,最适温度为40℃。【结论】成功克隆表达阴沟肠杆菌的Cel8A基因,并证实该基因编码的蛋白质具有β-1,4-内切葡聚糖酶活性,为进一步研究阴沟肠杆菌的纤维素酶组成以及纤维素降解机理奠定了基础。     

不同品种马铃薯淀粉及其直链淀粉、支链淀粉含量的测定

对甘肃省主要种植马铃薯品种的淀粉含量以及淀粉中直链淀粉和支链淀粉的比例进行了定量分析与比较.结果表明:不同品种马铃薯淀粉中直链淀粉和支链淀粉含量不同,由此造成不同品种马铃薯淀粉性质的差异.     

连续流动法测定新鲜烟叶中的直链淀粉和支链淀粉

烟叶中直链淀粉和支链淀粉的含量与烟叶的品质和产量有着重要的关系,检测新鲜烟叶中淀粉含量,对于掌握烟株生长和烟叶品质有重要意义.直链淀粉和支链淀粉是烟草中较难测定的成分.研究以高氯酸为提取剂,建立了一种快速、准确测定新鲜烟叶中直链淀粉和支链淀粉的分析方法.方法的操作步骤是,采用液氮研磨剪碎的鲜烟叶,用乙醇-饱和氯化钠溶液脱色,40%高氯酸溶液提取,直链淀粉采用在线氢氧化钠碱液分散二次进样显色,选择波长600 nm的滤光片,支链淀粉采用直接进样显色,选择波长570 nm的滤光片,连续流动法测定烟草中2种淀粉含量.直链淀粉和支链淀粉的检出限分别为0.49 mg/g和0.37 mg/g,平均回收率分别为111.97%和104.41%.方法对两种淀粉的相对标准偏差均在5%以内.     

基于Cp-曲线的蛋白质序列相似性分析

蛋白质是生物体内行使重要功能的生物大分子.蛋白质的功能是由其空间结构决定的,而蛋白质的空间结构取决于其一级序列.因此,研究蛋白质的氨基酸序列就成为蛋白质结构预测的前提和基础,并已经成为生物学家关注的主要研究内容之一.主要介绍基于20种氨基酸的一种5-L模型,将蛋白质序列粗粒化为5-L序列,进而给出蛋白质序列的一种3-D图形表示,称之为Cp曲线.将Cp曲线转化为容易比较的序列不变量,并在此基础上对11个物种β-球蛋白质序列进行相似性分析.     

蛇莓乙醇提取物抑制尖吻蝮蛇毒蛋白水解酶活性初探

【目的】初步探究蛇莓(Duchesnea indica)对尖吻蝮(Deinagkistrodon acutus)蛇毒蛋白水解酶的抑制作用。【方法】采用不同极性有机溶剂对蛇莓乙醇提取物进行分级萃取,结合硅胶薄层层析(TLC)进行分离,再利用气相色谱-质谱法(GCMS)对抑制蛋白水解酶作用最强的活性部位进行组分分析。【结果】乙酸乙酯萃取相具有较强的抑制尖吻蝮蛇毒蛋白水解酶活性;经硅胶TLC分离从中获得条带1、条带2、条带3和条带4共4个条带,且条带4的尖吻蝮蛇毒蛋白水解酶抑制活性最强。通过GC-MS分析检测出条带4中存在15种成分,其中2,4-二叔丁基苯酚、正十六烷酸、十八烷酸、十六烷酸,2-羟基-1-(羟甲基)乙酯、硬脂酸-2-羟基-1-(羟甲基)乙酯和10,13-十八碳二炔酸甲酯可能与抑制蛇毒活性相关。【结论】蛇莓中存在抑制尖吻蝮蛇毒蛋白水解酶的功效组分,可以作为蛇伤药物开发的资源。     

结晶紫表面增强拉曼与时间关系研究

【目的】研究银包金纳米颗粒(Ag@AuNP)对结晶紫信号的增强效果与时间的关系。【方法】用新型纳米材料银包金纳米颗粒作为拉曼增强基底,采用785nm激光激发结晶紫表面增强拉曼光谱,统计光谱特征峰强度变化趋势。【结果】结晶紫725cm-1,801cm-1,914cm-1,1177cm-1,1392cm-1,1588cm-1等特征峰强度在0~30min内随时间的延长而逐渐升高,达到一个平台后随时间(30~36min)的增加基本保持不变。【结论】最优最快的结晶紫表面增强光谱的测定时间约为30min,该结论丰富了表面增强拉曼的研究成果。     

两株氧化葡萄糖酸杆菌静息细胞的催化性能比较

【目的】氧化葡萄糖酸杆菌是一种严格好氧的革兰氏阴性菌,能够立体选择性氧化多种羟基化合物生成相应的醛、酮或酸。【方法】本文将比较两株氧化葡萄糖酸杆菌DSM 2003和621H的静息细胞对甘油、乙二醇及乙醇的催化能力,并研究了溶氧对催化反应的影响。【结果】两株氧化葡萄糖酸杆菌氧化甘油的能力较相似,溶氧对这两株菌的甘油催化能力都有较大影响;氧化葡萄糖酸杆菌DSM 2003能够将乙二醇几乎全部氧化为羟基乙酸,副产物少,而621H转化相同量的底物只生成较少量的羟基乙酸,副产物多。氧化葡萄糖酸杆菌621H生产乙酸的能力也很低。【结论】两株氧化葡萄糖酸杆菌催化甘油生成二羟基丙酮的能力相当,但在催化醇生成酸的反应中,氧化葡萄糖酸杆菌DSM 2003更具优势。     

木薯生料发酵生产高浓度燃料乙醇工艺研究

【目的】对木薯生料发酵生产高浓度燃料乙醇的工艺进行研究,为其工业化生产奠定基础。【方法】首先通过单因素试验确定发酵中主要影响因素的最佳水平,然后利用响应面法对主要因素的相互作用进行研究,最后对发酵温度进行梯度降温控制,以提高乙醇的产量。【结果】单因素试验确定主要影响因素的最佳水平:颗粒淀粉水解酶用量为0.8GAU/g木薯粉,底物浓度为36%(W/V),初始pH值为4.2。响应面法优化的结果:颗粒淀粉水解酶用量为0.82GAU/g木薯粉,底物浓度为37%(W/V),初始pH值为4.3。对发酵温度进行梯度降温控制,则可降低醪液残糖,提高原料转化率。在技术集成基础上,对木薯生粉发酵96h,醪液乙醇产量可达16.24%(V/V),残还原糖含量为0.29%(W/V),残总糖含量为1.81%(W/V)。与初始条件相比,乙醇产量提高25%。【结论】木薯生料发酵生产高浓度燃料乙醇,在技术集成基础上可降低能耗,节约生产成本,具有较好的工业化应用前景。     

鱼油与微藻和植物油脂肪酸成分比较及其替代策略分析

【目的】水产养殖业的快速发展和鱼油价格的快速上涨,使得寻找能够替代鱼油的脂肪源日趋紧迫。【方法】采用直接转酯化进行气相色谱鉴定的方法测定鱼油、多种常见植物油和两种微藻的脂肪酸组成,以37种脂肪酸标准品作为参照,比较分析3类脂肪源的异同。【结果】鱼油的脂肪酸组成与微绿球藻(Nannochloropsis sp.)和裂壶藻(Schizochytriumsp.)相似,但植物油与鱼油相比缺乏EPA和DHA等n?3高不饱和脂肪酸。在满足必需脂肪酸需求的前提下,提出两种替代鱼油的策略:1使用38.0%亚麻籽油配合27.7%微绿球藻藻油和34.3%裂壶藻藻油替代鱼油的策略获得与鱼油一致的n?3/n?6多不饱和脂肪酸比率,能够较好地满足鱼类的营养需求,可作为替代鱼油的首选策略;2使用38.0%大豆油配合27.7%微绿球藻藻油和34.3%裂壶藻藻油替代鱼油的策略则获得与鱼油大体相同的主要脂肪酸类别,价格较亚麻籽油组低廉,可作为备选策略。【结论】使用高EPA和DHA含量的微藻藻油配合植物油替代鱼油在理论上是可行的。     

金黄色葡萄球菌细胞内生物大分子含量变化的光镊拉曼光谱研究

【目的】利用光镊拉曼光谱技术(Laser Tweezers Raman Spectroscopy,LTRS)研究金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)细胞内主要生物大分子含量的动态变化,探寻监测微生物代谢状态变化的有效工具。【方法】收集分批培养过程不同时间点金黄色葡萄球菌细胞的拉曼光谱,观察其特征峰依赖时间的变化特点。【结果】归属于核酸的特征峰,如667cm~(-1)峰,724cm~(-1)峰,781cm~(-1)峰,809cm~(-1)峰和1 574cm~(-1)峰在整个分批生长阶段持续降低,在对数生长期下降幅度尤其剧烈,反映了对数生长期细胞分裂快速,DNA复制活跃;与蛋白质相关的特征峰,如850cm~(-1)峰,1 001cm~(-1)峰和1 662cm~(-1)峰,在对数生长期显著增强,而到稳定期峰强度基本维持恒定。【结论】光镊拉曼光谱技术能实时监测生物样品内生物大分子的含量,是单细胞水平上研究微生物代谢状态变化的有效工具。     

Si衬底掺杂浓度对InGaN/Si异质单结太阳电池性能的影响

【目的】研究p-Si衬底掺杂浓度对InGaN/Si异质单结太阳电池性能的影响,为制备高效太阳电池提供理论基础。【方法】将器件的n-InGaN掺杂浓度固定为10~(16 )cm~(-3),在改变p-Si衬底掺杂浓度N_A的情况下,采用一维光电子和微电子器件结构分析模拟软件(AMPS-1D)对InGaN/Si异质单结太阳电池器件的各项性能参数进行模拟。【结果】随着掺杂浓度N_A的升高,电池的电流密度J_(SC)和填充因子FF随之升高,当到达一定高的掺杂浓度范围时(N_A5.00×10~(17)cm~(-3)),J_(SC)基本保持不变,约为28.12mA/cm~2,FF保持在0.85左右且变化不大。开路电压V_(OC)和光电转换效率E_(ff)与掺杂浓度的大小呈正相关关系,随着N_A的增大,V_(OC)、E_(ff)缓慢增大。【结论】高掺杂浓度下的太阳电池具有较好的光电转换效率。低掺杂浓度的太阳电池光电转换效率较低,这是因为其对应的尖峰势垒高度和宽度均较大,影响了光生载流子的输运。     

基于遥感资料和观测数据的重点海域海表盐度评估分析

【目的】通过验证Aquarius海表盐度遥感产品数据在不同大洋和波束的反演精度,为其应用提供依据。【方法】基于自沉浮式剖面探测浮标Argo(Array for real-time geostrophic oceanography)盐度观测数据评估Aquarius卫星在重点海域(太平洋、大西洋、印度洋)和不同波束对应的海表盐度产品精度。【结果】相对于波束2和波束3,波束1海表盐度与Argo观测最为接近,偏差和均方根差分别为0.003psu和0.397psu。与大西洋和印度洋相比,太平洋反演精度最高。在中纬度地区,盐度偏差较小,约为0.1psu;在南北纬20°和高纬度区域,盐度偏差较大,约为0.2psu;低海温和高风速对盐度误差也有重要贡献,低海温对应的弱亮温信号和高风速下的不准确的海面粗糙度模型是导致盐度偏差的主要因素。此外,利用Argo月平均海表盐度观测数据评估了Aquarius卫星海表盐度三级产品,均方根差在0.27~0.34psu之间,平均值为0.31psu。在二级和三级产品中,V3.0SSS_bias_adj的均方根差相比V3.0SSS均降低约0.04psu。【结论】与V2.0数据产品相比,V3.0二级产品精度有了的较大提高,三级产品无明显改善,升轨和降轨的偏差依然存在。海表温度校正能够提高盐度反演的精度,使得均方根误差下降0.04psu。     

球形棕囊藻北部湾株对不同形态磷源的利用及碱性磷酸酶特性研究

【目的】探讨球形棕囊藻(Phaeocystis globosa)北部湾株BBW PG-01对不同磷源利用能力的差异以及碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase,AP)特性,揭示溶解有机磷(Dissolved organic phosphorus,DOP)在该藻赤潮发生时的重要作用。【方法】在实验室培养条件下,以KH_2PO_4(PO_4~(3-))、核糖核酸(RNA)、葡萄糖-6-磷酸钠盐(G-6-P)、三磷酸腺苷二钠(ATP)和卵磷脂(LEC)作为磷源,对比研究BBW PG-01在这5种不同磷源培养条件下的生长特征及碱性磷酸酶活性(Alkaline phosphatase activity,APA),并结合磷饥饿条件下的无机磷吸收动力学及碱性磷酸酶动力学分析其对无机磷和有机磷的竞争机制。【结果】5种形态磷源均可被BBW PG-01利用,RNA为其最优生长磷源,而以大分子有机磷LEC为磷源时生长最差,两者最大细胞密度分别为4.40×10~8 cells/L和2.39×10~8 cells/L,水解大分子DOP可能需要更高的酶活性。动力学研究结果表明,在磷缺乏的条件下,BBW PG-01具有通过高亲和力来竞争磷源以维持生长的能力。【结论】球形棕囊藻北部湾株在AP的作用下,能够利用多种DOP进行生长,且在低磷条件下对无机磷(DIP)和DOP均具有较强的竞争能力,海洋中DOP可能是球形棕囊藻赤潮暴发和维持的重要磷源。     

糖蜜酒精废液脱钾树脂的解吸动力学

【目的】研究糖蜜酒精废液脱钾树脂BK-001中K~+的静态解吸过程。【方法】考察洗脱剂温度、浓度及树脂粒径对K~+解吸过程的影响,用动边界模型描述K~+的解吸过程。【结果】确定糖蜜酒精废液脱钾树脂BK-001中K~+的解吸过程为颗粒扩散控制,该反应的表观活化能为40.9kJ/mol,反应级数为1.19,表观频率因子为5.27×10~4 min~(-1),假二级动力学模型更适合描述K~+的解吸过程(R~20.995)。K+解析过程的总动力学方程式为1-3(1-F)~(2/3)+2(1-F)=5.27×104r20[H2SO4]~(1.19)e_((-4.09×10~4))/RT。【结论】脱钾树脂BK-001的解吸动力学方程为糖蜜酒精废液脱钾树脂的再生及钾盐资源的综合利用提供理论依据。