北京地区家蝇(Musca domestica L.)乙酰胆碱酯酶(AChE)动力学性质研究

实验结果表明,在北京地区家蝇种群以及实验室敏感系和用残杀威选育的抗性种群中,其乙酰胆碱酯酶(AChE)对乙酰硫代胆碱的米氏常数(K_m)值最大相差4倍,最大反应速度(V_(max))相差近8倍。敌百虫与家蝇AChE的双分子速率常数(Ki)值,农大敏感品系(SA)为7.41×10~4(L/mol,分~(-1)),而北京宜武种群AChE的Ki值仅为5.13×10~2,相差达144倍,崇文、密云和回龙观种群AChE的Ki值和SA品系相比,差异也在10倍以上,说明北京地区家蝇AChE对敌百虫的敏感度明显降低了。这些家蝇种群的AChE对敌百虫的亲合力(解离常数Kd)和SA品系相比,宜武种群相差近2890倍,其它种群也相差50倍以上,而磷酸化速率常数(k_2)则相差不大,说明北京地区家蝇对敌百虫的敏感度降低是由于解离常数—Kd值的改变造成的。     

农药靶标乙酰胆碱酯酶的分离纯化及性质研究

采用了Sephadex G-25层析,DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换层析和Sephacryl S-200凝胶过滤层析,对家蚕头部粗酶匀浆液中的乙酰胆碱酯酶进行纯化,得到的样品经聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）和SDS-PAGE检测均为一条带,用SDS-PAGE法测得其分子量为77.8 kDa.酶的最适反应温度为37 ℃,最适pH为7.5,对底物碘化硫代乙酰胆碱(ATChI)的Km值为0.392 mmol/L,最适底物浓度为1.6 mmol/L,在1.6 mmol/L底物浓度以上观察     

乙酰胆碱酯酶壳聚糖膜的制备研究

以新鲜母鸡血为材料,30%～70%(V/V)乙醇分步沉淀制备粗酶制剂,再经DEAE-Cellulose与Sephadex G-75 柱层析,部分纯化鸡红细胞乙酰胆碱酯酶(AChE),再以壳聚糖制备成膜作为载体,采用吸附-交联法固定AChE制备壳聚糖酶膜,分别考察制备壳聚糖酶膜的壳聚糖浓度(0、0.05、0.1、0.15、0.2g/ml),壳聚糖酶膜的吸附时间(2、4、6、8、10、12h)和吸附温度(0、4、25、30、37℃),以及戊二醛质量浓度(0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%),戊二醛交联时间(40、80、120、160、1200min),戊二醛交联温度(0、4、25、37℃)和给酶量(0～2000U/ml)对壳聚糖酶膜固定化效果的影响.结果显示,鸡红细胞AChE粗酶制剂的部分纯化倍数为12倍时,活力回收34.1%.优化的固定化条件是以0.1g/ml壳聚糖溶液制备载体膜,采用950 U/ml的酶液(蛋白质含量为 0.43 mg/ml),在4℃下吸附10 h,再以质量浓度为0.6%的戊二醛溶液4℃下交联2h.此条件下制备的酶膜活力达11.5 U/cm2,活力回收达 30%.     

小菜蛾Plutella xylostella羧酸酯酶、酰胺酶及乙酰胆碱酯酶的研究

研究结果表明,小菜蛾(Plutella xylostella)乙酰胆碱酶、酰胺酶的最适pH值分别为8.0和8.5。pH值对闳酸酯酶活力影响较小,酰胺酶和羧酸酯酶反应速度在反应开始60钟内,仍在线性范围,乙酰胆碱酯酶反应速度在反应开始的8分钟内呈线性关系。羧酸酯酶、酰胺酶和乙酰胆碱酯酶的Vmax分别为551.81(nmol/mg,mln)、5.25×10~(-4)(μmol/mg.min)和20.36(nmol/mg.min);km分别为5.52×10~(-5)(mol)、1.18×10~(-3)(mol)和8.33×10~(-3)(mol)。     

凝胶法固定乙酰胆碱酯酶的研究

以海藻酸钠为载体包埋固定乙酰胆碱酯酶(AChE),考察了影响酶固定化的重要因素,获得了最佳固定化条件。实验结果表明,将1U乙酰胆碱酯酶,2μLφ(戊二醛)为5%的戊二醛,1μL10g/L的牛血清白蛋白(BSA),与30g/L的海藻酸钠配成300μL的酶溶液,滴入20g/L的氯化钙溶液中,3℃下固定8h,制备的凝胶酶珠机械强度高,活力重现性好。在20g/L的氯化钙溶液中3℃下保存40d,活力基本不变,相对标准偏差为5.53%～6.82%。     

3种农药对花鲈抗氧化酶和乙酰胆碱酯酶影响的研究

采用体外方法,研究了敌敌畏(Dichlorvos)、丁硫克百威(Carbosulfan)和氯氰菊酯(Cypermethrin)等3种农药对花鲈(Lateolabraxjaponicus)肌肉中乙酰胆碱酯酶(AChE)和肝脏中谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)、谷胱甘肽转移酶(GST)及超氧化物歧化酶(SOD)等抗氧化酶的急性毒性效应.浓度为50、200、500、1000mg/L的3种农药分别与花鲈肌肉和肝脏匀浆液在25℃孵育0、30、60、90min后,测定各酶的活性.实验结果表明,3种农药对AChE、GPx和GST活性有不同程度的抑制,但对SOD活性无显著影响.     

蚯蚓乙酰胆碱酯酶的分离与固定化试验研究

从蚯蚓中提取乙酰胆碱脂酶,通过硫酸铵盐析,离子交换层析等方法获得了较纯的胆碱酯酶,并对其部分性质进行测定.分别采用鸡蛋膜固定化法,活化载体-共价结合法和戊二醛交联法进行酶的固定.结果表明:蚯蚓体内乙酰胆碱酯酶含量较低,且纯化过程中损失较大,结果欠佳;活化载体-共价结合法固定得到的乙酰胆碱酯酶酶膜活性高,酶不易损失,重现性好.为建立快速的痕量有机磷类的酶法分析方法奠定了基础.     

玻璃纤维素壳聚糖膜固定乙酰胆碱酯酶的研究

以玻璃纤维素壳聚糖膜为载体,戊二醛为交联剂,进行乙酰胆碱酯酶(AChE)的固定,并对固定化酶的理化性质进行研究.结果表明,乙酰胆碱酯酶的较佳固定化条件为:150 U/mL AChE液50μL,体积分数为5%的戊二醛溶液50μL,质量分数为1%的BSA100μL,pH值为8.0的0.2 mol/L PBS缓冲液,配制成1 mL酶液,玻璃纤维素壳聚糖膜浸于此酶液4℃固定8 h.固定化酶的最适作用温度37℃,最适pH 8.0,能够重复利用4次以上,表明该固定化酶的稳定性较高.     

2种拟青霉代谢产物对烟蚜乙酰胆碱酯酶和羧酸酯酶的影响

 以粉拟青霉菌的sw03032菌株和玫烟色拟青霉菌的sw03085为研究对象,比较其代谢产物的杀蚜虫活性和对烟蚜乙酰胆碱脂酶和羧酸酯酶活性的影响.结果表明2种真菌发酵液含有能毒杀蚜虫的毒素物质.且毒素粗提物浓度越大,杀蚜活性越强.经玫烟色拟青霉菌不同浓度毒素粗提液处理的蚜虫乙酰胆碱酯酶比活力分别比对照(CK2)降低了70.4%～29.8%.不同浓度玫烟色拟青霉菌毒素粗提液处理12h后,蚜虫羧酸酯酶比活力分别比对照(CK2)降低79.5%～44.4%.用不同浓度粉拟青霉菌毒素粗提液处理烟蚜12h后,乙酰胆碱酯酶和酸酸酯酶活性分别降低了38%～18.6%和51.6%～59.5%.玫烟色拟青霉菌的sw03085菌株代谢产物对烟蚜的伤害活性明显较粉拟青霉菌sw03032菌株代谢产物高.     

意大利蜜蜂转铁蛋白基因AmTsf在吡虫啉胁迫下的表达分析

【目的】通过生物信息学方法鉴定意大利蜜蜂(Apis mellifera ligustica)转铁蛋白(AmTsf),分析该蛋白在该蜂种耐受杀虫剂吡虫啉毒性过程中发挥的作用。【方法】通过多重序列比对分析AmTsf的氨基酸序列特征和结构域组成;利用在线工具预测该蛋白的结构、细胞定位、互作蛋白网络和生物学功能,构建系统进化树分析该蛋白的系统分类和进化关系;采用实时荧光定量PCR结合铁稳态测定分析该蛋白的编码基因AmTsf在意大利蜜蜂耐受杀虫剂吡虫啉毒性过程中的应答特征和功能。【结果】AmTsf蛋白为疏水性蛋白,由712个氨基酸残基组成,相对分子质量为78.7 kDa, pI为6.77,具有信号肽和转铁蛋白家族保守的氨基酸残基,主要定位于细胞核和线粒体。环境剂量的吡虫啉暴露导致供试蜜蜂大量死亡;与对照组相比,吡虫啉暴露24 h后导致供试蜜蜂头部、胸部和中肠的Fe²⁺过剩,与铁稳态调节紧密相关的AmTsf在上述各组织中的表达均有统计学意义上的上调(p<0.05)。【结论】AmTsf可能通过调节铁稳态来参与意大利蜜蜂对吡虫啉毒性的耐受。     

含毒死蜱有效成分的杀虫剂对意大利蜂(Apis mellifera L.)的经口毒性

采用摄入法在室内测定了7种含有毒死蜱有效成分的杀虫剂对成年意大利蜂的急性经口毒性.结果表明:所测定的7种杀虫剂对成年意大利的急性经口毒性均为高毒;毒力由高到低的顺序是:10％阿维·毒死蜱乳油＞12％高氯·毒死蜱乳油＞50％毒死蜱微乳剂＞30％甲维·毒死蜱乳油＞30％毒死蜱·三唑磷乳油＞20％毒死蜱·氟铃脲乳油＞22％吡虫·毒死蜱乳油.另外,22％吡虫·毒死蜱乳油对供试蜜蜂24h和48h的致死作用存在明显的差异,其24h LC50值约是48h LC50值的12.6倍.     

四个意大利蜜蜂品系苹果酸脱氢酶Ⅱ基因的遗传差异分析

研究了意大利蜜蜂(A.m.ligustica)4个王浆、蜂蜜生产性能不同品系-美意(Em)、澳意(Eo)、苏意(Es)和平湖浆蜂(Ep)的MDHⅡ同工酶基因型频率、基因频率及杂合纯合度.试验发现,MDHⅡ的a、b、c三个等位基因在4个品系中出现的频率不同.c在Em、Eo、Es和Ep中的基因频率分别为0.507、0.483、0.680和0.820,为优势等位基因.该结果表明在产浆性能高的品系中c基因频率较高,意味着可将c基因频率作为意蜂王浆产量性能的一个遗传标记.等位基因a在Em、Eo、Es和Ep中频率分别为0.323、0.263、0.193和0.087;在Em中出现的频率最高.而等位基因b在Eo中频率(0.253)高于其他3个品系(Em,0.170;Es,0.127;Ep,0.093).Ep的纯合度最高,达0.753,高于Em(0.533)、Eo(0.633)和Es(0.540).经独立性检验,4个意蜂品系MDHⅡ同工酶的基因型频率、基因频率、纯合度均达到极显著差异水平.     

东方蜜蜂微孢子虫胁迫下意大利蜜蜂工蜂的piRNA差异表达谱及潜在功能

为探究东方蜜蜂微孢子虫(Nosema ceranae)胁迫下意大利蜜蜂(Apis mellifera ligustica,简称意蜂)工蜂的piRNA差异表达表达谱及潜在功能,本研究利用前期获得的东方蜜蜂微孢子虫接种7 d和10 d的意蜂工蜂中肠(AmT1组和AmT2组)及未接种工蜂中肠(AmCK1组和AmCK2组)转录组数据筛选出宿主响应胁迫的差异表达piRNA(Differentially expressed piRNA, DEpiRNA),并通过相关软件预测和分析DEpiRNA的靶mRNA,进而利用Stem-loop RT-PCR和qPCR对随机选取的DEpiRNA进行验证.结果显示在AmCK1 vs AmT1和AmCK2 vs AmT2比较组分别筛选出50和207个DEpiRNA;上述两个比较组共有的DEpiRNA为10个,特有的DEpiRNA分别为40和197个;共有的DEpiRNA piR-ame-1128833可靶向3021条mRNA;Stem-loop RT-PCR验证结果显示4个DEpiRNA均真实表达;qPCR结果显示4个DEpiRNA的表达趋势与测序数据中的表达趋势...     

高表达lncRNA调控意大利蜜蜂工蜂中肠发育的作用解析

为了探究高表达lncRNA(highly-expressed lncRNA, HlncRNA)调控意大利蜜蜂(Apis mellifera ligustica,简称意蜂)工蜂中肠发育的潜在作用,本研究利用前期获得的组学数据筛选出意蜂7和10日龄工蜂中肠的HlncRNA,通过RT-PCR验证上述HlncRNA的真实表达,通过RT-qPCR分析HlncRNA在1～21日龄工蜂中肠发育过程的表达谱,进而对HlncRNA的调控作用进行生物信息学分析.结果表明7和10日龄工蜂中肠中表达量最高的9条lncRNA相同;这些HlncRNA在1～21日龄工蜂中肠发育过程中真实表达且表达规律不同;HlncRNA通过顺式和反式作用分别调控32个上下游基因和18条共表达mRNA,此外可靶向55个miRNA进而结合131条mRNA.研究结果揭示上述9条HlncRNA可通过顺式作用、反式作用和ceRNA网络潜在调节应激反应与糖类消化和吸收等功能条目和通路,进而调控意蜂工蜂的中肠的发育.     

意蜂苹果酸脱氢酶同工酶的电泳表型和基因型

用聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦电泳测定了意蜂不同级别和不同发育阶段的苹果酸脱氢酶(MDH)同工酶。意蜂的MDH有3个区带,其中MDHⅡ由3个等位基因编码,雌性峰是双倍体,有6种电泳表型,纯合子和杂合子各3种。雄性蜂是单倍体,有3种电泳表型。雌蜂和雄雌的幼虫与其成虫的酶谱相同。蛹期有1～2条附加带,卵期测不出MDHⅡ的活性。     

黄边糙鸟蛤生殖腺的组织学研究

采集黄边糙鸟蛤成年个体,并进行活体解剖和显微镜观察.结果表明:性成熟个体为雌雄两性功能同体存在的同步性雌雄同体.性腺由树枝状分枝的生殖管、输精管和输卵管组成.生殖管反复分枝成生精小管、生卵小管及其末端膨大的生殖泡囊.性腺由外膜及其内生精小管和生卵小管盘绕交错排列构成.外膜含单层上皮及薄层肌肉,生殖小管和泡囊皆由位于基膜上的生殖上皮构成,生殖上皮不断向腔内增殖各阶段生殖细胞.本文详细描述了精原细胞、卵原细胞、精母细胞、卵母细胞以及精子和卵子的形态结构.此外,还报道了极少数黄边糙鸟蛤性腺存在一些雄性滤泡转化为雌性滤泡现象.     

柑橘凤蝶形态特征及年生活史研究

野外采集卵、幼虫,在玻璃温室内供以幼虫寄主植物、成虫蜜源植物饲养,第2、3代及越冬代皆为第1代后代,观察研究柑橘凤蝶各虫态、各虫龄与发育历期.结果表明,柑橘凤蝶在郑州地区一年可完成3代,卵期为5⁷ d,幼虫5龄,幼虫期157 d,幼虫5龄,幼虫期15²4 d,蛹期924 d,蛹期9¹5 d,越冬蛹期14015 d,越冬蛹期140¹56 d,成虫期10156 d,成虫期10¹2 d.同时记录、描述了柑橘凤蝶各虫态、幼虫5个龄期外部形态及生物学习性.     

中华蜜蜂工蜂复眼的胚后发育研究

通过形态解剖、免疫组织化学、原位细胞凋亡检测等技术,对中华蜜蜂工蜂复眼的胚后发育过程进行了比较研究.结果表明:中华蜜蜂的复眼产生自幼虫头壳表皮的眼分化中心.在3龄幼虫出现的形态发生沟沿背-腹轴方向扫过整个复眼发生区,其后部细胞聚集成群,最终形成光感受器.细胞的增殖从幼虫早期开始,到末龄幼虫达到高峰;活跃分裂的细胞主要集中在两条形态发生沟外侧的增殖细胞带内;那里的细胞凋亡也非常活跃.中华蜜蜂视觉细胞发出的视神经进入前脑大约是在蛹发育的第5天.