根癌农杆菌介导苜蓿体胚转化及转基因植株再生

用含质粒载体pCAMBIA2301(带有受CaMV35S启动子调控的GUS基因和nptⅡ基因)的根癌农杆菌Agrobacterium tumefaciens转化晋南苜蓿Medicago sativa L.cv.Jinnan的体胚组织,发现负压处理有利于提高转化频率(可达35%),3批共158个体胚切块的转化实验共获得具有卡那霉素抗性的再生植株15株,经组织化学染色和分子检测,证实GUS基因已整合到转化植株基因组中,在芽、叶片、叶柄和根等组织中均有表达,并在土壤栽培过程中保持稳定的表达.     

Fibrillin转基因油菜的再生及其光合特性的检测

用根癌农杆菌共培养法，以带有1～2 mm子叶柄的完整子叶为转化受体，将连有35S启动子和NPTⅡ标记基因的Fibrillin cDNA导入甘蓝型油菜主要栽培品种“2005南系”中，获得抗卡那霉素的转基因植株.对部分经卡那霉素筛选得到的再生植株进行PCR检测，有来自3个株系的植株表现为阳性，初步证实外源基因已整合到植物细胞基因组中.将转基因植株炼苗后移入大田，在3月初到4月末油菜开花结果期间，对叶片和角果进行光合指标和叶绿素荧光指标的检测以及产量性状分析，发现转基因植株和非转基因植株之间存在明显差异.     

Micro-Tom番茄转基因植株再生体系的优化

转基因植株的再生频率较低一直是植物基因工程研究的瓶颈之一.以番茄的MicroTom突变体为材料,探索了外植体植物激素配比、预培养时间、共培养时间、筛选剂对愈伤组织发生和不定芽生长的影响.结果表明:子叶比下胚轴更适合作为愈伤组织和不定芽诱导的外植体;当玉米素(zeatin,ZT)质量浓度为0.5 mg/L,吲哚乙酸(indole acetic acid,IAA)质量浓度为1.0 mg/L时最有利于不定芽诱导;外植体预培养的适宜时间为3 d,农杆菌和外植体共培养的适宜时间为2 d;外植体对卡那霉素的耐受上限为40 mg/L,替门汀的适宜质量浓度为150 mg/L.实验所建立的转基因再生体系为Micro-Tom番茄的遗传工程应用奠定了基础.     

本生烟组织培养及遗传转化体系的建立

本文研究了通过农杆菌侵染获得本生烟(Nicotiana benthamiana)转基因植株的方法。将本生烟中上部叶片消毒后切成5mm×5mm左右的小块作为外植体,在含有6-BA(3mg/L)和NAA(0.2mg/L)的MS培养基中培养2~3d,用含有表达载体的农杆菌侵染后共培养3~4d,转入含有6-BA(3mg/L)、NAA(0.2mg/L)和卡那霉素(100mg/L)的MS培养基中培养2~3周。将外植体边缘产生的愈伤组织和芽点转移到只含有卡那霉素(100mg/L)的MS培养基中继续培养,2周后分化出大量不定芽。继续培养2周,当芽长1~3cm时,将芽转移到含IBA(0.1mg/L)的MS培养基中分化生根,得到再生植株。当再生植株高8~10cm、根长4~5cm以上时,移栽到经过灭菌的营养土中。通过实时荧光PCR扩增,从获得的植株中检测35S启动子和NOS终止子外源基因片段,判定所得的植株的确为转基因植株。最后对本生烟组织培养中应该注意的问题进行了讨论。     

含编码类铁氧还双亲性蛋白ap1基因的转基因水稻植株的获得

利用基因枪法将含有潮霉素抗性基因（hpt),gusA报告基因和ap1基因的2个质粒（pJIMB15和pBiSAP1)共同转化同转化由粳稻品种鄂宜105号种 子在胚诱导的愈伤组织（2－3周龄）。ap1基因编码一种双亲性的蛋白。该蛋白能延缓因假单孢菌感染所引起的非寄主植物中的过敏反应。经过2轮潮霉素（30mg/L)筛选,抗性愈伤组织被转入含30mg/L潮霉素的再生培养基中再生植株。从轰击的186块愈伤组织中共再生出32株独立的转基因水稻植株（转化率为17．2％）,PCR／Southern blot分析显示84％的转基因植株含有所有3个基因。     

外源基因在转基因油菜后代中的表达及遗传学分析

以转基因油菜后代（Ｒ１和Ｒ２代）株系为材料，系统地研究了苏云金杆菌杀虫蛋白基因ＣｒｙⅠＡ和选择标记基因ｎｐｔⅡ导入油菜后的遗传规律，表达强度和抗虫效应。结果表明：Ｒ１代卡那霉素抗性为３：１分离方式，在Ｒ２代卡那霉素抗性植株中，有三分之一为ｎｐｔⅡ基因纯合型（Ｔ：Ｔ）另三分二为复合型（Ｔ：Ｏ），其遗传方式符合孟德尔单因子显性遗传；转化植株可耐受１５０ｍｇ／Ｌ那卡霉素的选择压力，约一半的转化植株具有杀     

农杆菌介导的二氢黄酮醇3''5''羟化酶cDNA对非洲菊的转化及对其花色的影响

通过非洲菊(Gerbera hybrida)组织培养建立起适合于农杆菌介导的基因转化受体系统，非洲菊叶柄外植体在MS 3mg／L BA 0．01mg／L NAA培养基中直接诱导芽生长，在MS 0．1mg／L NAA培养基中生根培养，获得再生植株，诱导率达57％。带有云南矮牵牛(Petunia hybrida)二氢黄酮醇3’5’羟化酶cDNA的pEH表达载体与农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）LBA4404融合后，与非洲菊叶柄外植体共培养3d，通过含有卡那霉素25mg/L和羧苄菁霉素500mg/L的选择培养，诱导出转基因非洲菊。经PCR和Southern分子杂交检测，证明目的基因已整合入非洲菊的基因组中，转基因非洲菊花色、花型及叶型都有显变化。     

应用农杆菌介导法的多年生黑麦草遗传转化研究

以草坪型多年生黑麦草Lolium perenne L.成熟种子为外植体,经过愈伤组织诱导和植株再生研究,建立了该草种的遗传转化体系,并成功地应用农杆菌介导法将克隆自辽宁碱蓬的甜菜碱醛脱氢酶基因(BADH)转移进多年生黑麦草,获得的转基因株系Gsc-LP5通过PCR检测证明了目的基因的存在,通过叶片离体检测法证明了作为检测基因随同质粒一同转入的抗潮霉素基因的表达,通过盆栽耐盐试验证明了转基因植株具有较强的耐盐能力.     

尾巨桉遗传转化系统建立的研究

以建立的尾巨桉(Eucalyptus urophylla×grandis)3226、3228无性系高频再生体系为基础，利用GUS染色组织分析法研究了预培养时间、侵染时间和共培养时间因素对尾巨桉茎段遗传转化的影响，探讨了适宜尾巨桉转化的卡那霉素与抑菌抗生素使用浓度.结果表明，较优的转化条件是:茎段外植体不需进行预培养而直接进行侵染（菌液浓度OD600值为0.5）3 min，共培养2 d，然后转移到含75 mg／L卡那霉素和300 mg／L头孢噻肟钠的筛选培养基上，进行转化植株的再生.3226、3228     

油菜耐热基因（BnTR1）转化多年生黑麦草丛生芽的研究

油菜耐热基因(BnTR1)克隆自油菜,编码一种E3连接酶.为验证它的抗逆功能,本研究用携带BnTR1和新霉素磷酸转移酶(neomycin phosphotransferase,nptⅡ)基因的植物表达载体pCAMBIA2301-TR1的根癌农杆菌EHA105,对多年生黑麦草丛生芽进行遗传转化.经共培养和巴龙霉素筛选培养,获得了175株抗性植株.通过PCR和RT-PCR检测,获得62株转基因植株.结果表明,外源BnTR1基因已整合到转基因植株基因组中并在转录水平上表达.初步抗旱检测表明,BnTR1基因能明显提高转基因植株的抗逆能力.     

农杆菌介导的DREB1A基因转化多花黑麦草及其转化体系的优化

采用携带卡那霉素抗性基因nptII和GUS基因的ubiquitin启动子驱动的表达载体pBI121／DREB1A的根癌农杆菌AGL1, 对多花黑麦草幼胚来源的胚性愈伤组织进行了遗传转化,并优化了各种影响因素。胚性愈伤组织经根癌农杆菌感染和共培养后,用50mg／L巴龙霉素筛选抗性愈伤组织,待抗性愈伤组织在IB分化培养基上分化成苗后用25mg／L卡那霉素进一步筛选再生植株, 获得了部分抗性植株。抗性植株的总DNA用DREB1A基因的特异引物进行PCR检测,转化频率为2.14％,PCR-Southern blot进一步验证了转化植株基因组中含有该外源基因。各种影响转化效率因素的优化实验表明,当转化时菌液浓度的OD600为2.0、侵染时间为1h、共培养时间为2d、共培养温度为21℃及在共培养期间使用乙酰丁香酮等,均可明显提高转化频率。     

利用花粉管通道途径获得转基因小麦

将带有NPT-Ⅱ基因的质粒PGV用花粉管通道途径转化小麦烟农103,共结实1025粒,其中有718粒种子可以萌发出幼苗,在这718株幼苗中,经卡那霉素筛选,得到75棵绿色抗性植株,提取这些抗性植株的叶片总DNA,作NPT-Ⅱ基因的PCR扩增,有37株为阳性,转化率为5.16％,对其中9个PCR阳性植株的Southern杂交检测结果表明它们均为转基因植株.     

大豆子叶节组培再生系统与农杆菌介导的基因转化系统的比较研究

不同基因型的大豆子叶节在添加适宜BA的MS培养基上培养，可从子叶节诱导出高频丛生芽，并获得大量再生植株．通过农杆菌介导法，将深黄被孢霉△＾6—脂肪酸脱氢酶基因导入到栽培大豆吉林43和黑农37品种中．经过在含500mg/L卡那霉素的筛选培养基中连续筛选，获得一批转基因植株．经PCR检测和DNA分子杂交分析，初步证明外源基因已导入并整合到大豆基因组中．本重点阐述了组培再生系统和基因转化系统的内在联系和不同点．     

表达雪花莲外源凝集素基因的油菜转基因植株的获得

利用农杆菌素LBA4404（pCAMBIA3300RG)转化优良甘蓝型油菜恢复系W723的下胚轴节段.pCAM-BIA3300RG含有Rssl启动子引导的雪花莲外源凝集素基因（gna）和CaMV-35S启动子引导的除草剂抗性基因（bar）。经过两轮除草剂（2.5mg/L bialaphos）筛选（两周/轮）,除草剂抗性再生芽被传入生根培养基中生根,对根系旺盛生长的植株中所含gna基因进行PCR分析,PCR分析证实了这些植株确为转基因植株,利用Western印迹法对随机选择的5株含gna基因的转基因植株的分析发现,其中4株表达了gna基因。目前正对这些表达gna基因的转基因植株进行后代遗传分离分析。     

绿色荧光蛋白基因转化大岩桐的研究

利用农杆菌介导法 ,用含有绿色荧光蛋白基因的二元双价表达载体pBINm -gfp5 -ER转化大岩桐 ,并得到卡那霉素 (Kanamycin ,Kan)抗性再生植株 .对其进行初步PCR检测 ,结果表明 ,K2 0 0 (含Kan 2 0 0mg/L)培养基上的绿苗中有 3株PCR结果呈阳性 .对PCR阳性的植株进行了点杂交分析 ,均表现出较强的杂交信号 ,这说明外源基因已整合转入到大岩桐基因组中 .在荧光显微镜下观察转基因大岩桐 ,发现部分花、叶细胞均发出一定强度的绿色荧光     

陆地棉基因转移技术研究初报

应用农杆菌菌株Ａｔ４４０４携带抗卡那霉素基因（氨基葡萄糖磷酸转移酶）、Ｇｕｓ基因（葡萄糖苷酸酶）以及Ｂ．Ｔ毒蛋白基因，对陆地棉４个不同栽培品种鲁棉６号、鲁棉１０２４、中棉１２、中棉１９的无菌苗下胚轴和茎尖分生组织区作基因导入的研究，获得转基因的棉花试管苗．在以胚轴作为转化体系的培养过程中，只有鲁棉６号经过了愈伤组织发生、胚状体形成及植株再生途径．若以３～５ｄ的无菌苗芽顶端分生组织作为转化体系，经转化的茎尖分生组织培养在无激素或低浓度激素的ＭＳ培养基上，则可较容易地从多个品种中获得转基因的再生植株．以此方法进行基因转移，时间短、方法简便、不受品种来源及基因型的限制．这一技术将有利于提高棉花转基因植株的成活率     

雄性二倍体毛白杨再生体系的构建和遗传转化的研究

【目的】建立雄性二倍体毛白杨再生体系,构建稳定的遗传转化方法,为进一步研究毛白杨基因功能提供试验平台。【方法】以雄性二倍体毛白杨的幼嫩茎段和叶片为外植体,1/2 MS为基本培养基,通过调整6-BA、IAA和TDZ激素浓度进行再生体系筛选;采用农杆菌EHA105介导叶盘法,控制预培养时间、菌液浓度、侵染时间、共培养时间和卡那霉素筛选浓度,进行遗传转化;以幼嫩叶片原生质体为受体细胞,PEG介导转化荧光标记基因EGFP,进行瞬时表达。【结果】雄性二倍体毛白杨再生过程包括继代、芽伸长和生根3个阶段,其培养基组分分别为1/2 MS+0.5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA+0.005 mg/L TDZ、1/2 MS+0.5 mg/L 6-BA+0.3 mg/L NAA和1/2 MS+0.3 mg/L NAA+0.5 mg/L IBA,该条件下生根率为96.7%,增殖系数为4.47。遗传转化过程包括预培养、农杆菌侵染、共培养、抗性筛选和生根5个阶段,其中预培养为12 h、农杆菌浓度OD₆₀₀为0.4、侵染时间为20 min、共培养时间为24 h、卡那霉素(30 mg/L)筛选45 d和抗性苗生根20 d。试验共获得86株抗性植株,其中14株分子鉴定结果为阳性。在40% PEG4000的介导下,EGFP基因瞬间转化效率为50%。【结论】雄性二倍体毛白杨再生周期短、遗传转化稳定,是杨树基础研究的理想材料。本研究拓宽了杨树遗传转化体系,为杨树分子辅助育种提供了新途径。     

OsNHX1基因转化84K杨的研究

采用农杆菌介导的方法开展了水稻Na /H 逆向转运蛋白基因OsNHX1转化84K杨的研究.建立了84K杨的叶外植体高频再生系统,经诱导不定芽及诱导生根阶段卡那霉素连续筛选,获得了大量卡那霉素抗性转化植株.PCR检测和Southern杂交检测表明,OsNHX1基因已成功整合到84K杨基因组.耐盐实验表明,转基因植株能在200 mmol NaCl条件下正常生长.     

生菜基因转化组织培养受体系统的建立

以散叶生菜大速生（Lactuca sativa var. capatata L.）为试材,以MS为基本培养基,采用不同的激素配比,经愈伤组织诱导、芽分化、生根、移植入土四个步骤的离体培养,获得正常的再生植株,建立了散叶生菜大速生的基因转化受体系统,为下一步的基因转化工作提供了有利条件。高效诱导愈伤组织培养基为MS 0.5 mg/L 6-BA 0.1 mg/L NAA,高效诱芽培养基为MS 0.1 mg/L 6-BA 0.05 mg/L NAA。同时确定了子叶外植体对抗生素的敏感性。试验表明,筛选培养基中适宜的卡那霉素选择压在100 mg/L以下,抑菌剂羧苄青霉素或头孢噻肟钠的适宜质量浓度均为300 mg/L。     

根癌农杆菌介导AtNHX1基因转化小麦

利用根癌农杆菌对 3种基因型小麦进行了转化研究 .发现基因型对转化有明显影响 .将小麦品种烟优 36 1、烟 10 3、核生 3号的胚性愈伤组织用含报告基因NPTⅡ和抗盐基因Na H 反向转运AtNHX1的农杆菌菌株pROK2AT GV310 1感染和共培养后 ,用巴龙霉素 5 0 - 15 0mg L筛选抗性愈伤组织及转化植株 .对抗性植株的总DNA用AtNHX1基因的特异引物进行PCR检测 ,目的基因的PCR阳性频率为 1.3(烟 10 3)和 2 .9% (核生 3号 ) .Southern杂交证实外源基因已经整合到小麦的基因组中