新疆绵羊种布鲁氏菌GroEL基因的克隆及序列分析

参考牛种布鲁氏菌的GroEL（热休克蛋白）基因设计引物,扩增出新疆绵羊种布鲁氏菌GroEL基因片段,将其片段克隆到T载体上测序。结果表明：新疆源布鲁氏菌GroEL基因片段长1641bp,编码546个氨基酸,与羊种（B．melitensis）、猪种（B．suis）以及牛种（B．abortus）GroEL基因的核苷酸序列同源性分别为99．88％、99．82％、99．88％,推导的氨基酸序列同源性在99％以上,显示了很强的保守性。     

单增李斯特菌新疆临床分离株毒力基因的克隆和序列分析

为了研究单增李斯特菌新疆羊源临床分离的4b血清型菌株(简称LM90)毒力基因的变异情况,参考Genbank上收录的单增李斯特菌4b血清型菌株F2365(GeneBank登陆号AE017262)的Ami、Auto、InlB、InlC、InlJ基因序列,分别设计引物,对LM90的毒力基因Ami、Auto、InlB、InlC、InlJ的最大开放阅读框进行PCR扩增,回收基因序列,连接到PMD19-T载体上进行克隆,筛选阳性菌进行序列的测定,将序列提交到NCBI上(登录号分别为KF826613、KF826614、KF826611、KF703749、KF826612),测序后用DNAMAN软件对序列进行分析。结果显示:LM90的毒力基因Ami、Auto、InlB、InlC、InlJ与F2365毒力基因Ami、Auto、InlB、InlC、InlJ的同源性分别为98.04%、96.53%、98.20%、96.41%、98.23%,氨基酸的同源性分别为99.73%、99.83%、98.67%、99.66%、99.76%,可见单增李斯特菌新疆临床分离株LM90毒力基因Ami、Auto、InlB,InlC、InlJ序列相对稳定。     

禽流感病毒番鸭分离株HA基因的克隆及序列分析

禽流感病毒番鸭分离株ZM（A／Muscovy/Zhejiang/1/2000)经12日龄鸡胚增殖后纯化,提取病毒的基因组RNA,采用RT－PCR方法一次性扩增出17kb的特异性条带,与预计大小相符,将扩增产物提纯后克隆pGEM-T载体,酶切分析筛选到含1．7kb基因片段的阳性质粒,进一步对该片段进行测定及分析,结果表明：所扩增的基因延期长度为1732bp,含HA基因完整的阅读框架,编码568个氨基酸,同源性分析表明：该毒株起源于欧亚种系,与GD／96的HA基因核苷酸同源率高达99％,表明这两个株HA基因亲缘关系极为密切。     

绵羊β-乳球蛋白基因调控序列的分离、克隆及序列分析

根据绵羊β－乳球蛋白基因调控区ＤＮＡ序列设计了两个引物，以绵羊基因组ＤＮＡ为模板，用ＰＣＲ技术扩增，得约９００ｈＰ的ＤＮＡ片段插入到ｐＵＣ１８质粒的ＸｂａＩ／ＫｐｎＩ位点之间．ＰＣＲ产物的克隆经双酶切、ＰＣＲ检测和序列分析证明是绵羊β－乳球蛋白基因的调控序列．序列分析结果表明该克隆片段与绵羊β－乳球蛋白基因相应ＤＮＡ序列相比有很高的一致性．研究结果为指导异源基因的表达和进一步利用乳腺特异表达的转基因动物生产医用蛋白提供了有效的调控序列．     

羊大片吸虫龙岩分离株ITS基因的克隆及序列分析

应用PCR方法扩增龙岩地区羊片形吸虫分离株ITS序列,经克隆、测序后获得ITS全长序列944bp,其中ITS-1为421bp,ITS-2为361bp;通过在肝片吸虫和大片吸虫ITS种间鉴别位点上的序列分析表明,从龙岩地区羊体内分离的片形吸虫虫种属大片吸虫(命名为FgLY)。与国内外大片吸虫的进化分析表明,FgLY与中国云南的2个分离株处在一个小分支,亲缘关系最近。该结果为羊大片吸虫的进一步生物学研究和片形吸虫病的预防奠定了基础。     

绵羊防御素sBD-1 cDNA的克隆及序列分析

从成年绵羊舌表皮组织分离提取总RNA，经反转录PCR（RT-PCR)扩增出绵羊防御素sBD-lcDNA，将扩增片段回收，重组插入克隆载体T—vector，经限制性酶切鉴定和DNA序列测定，结果扩增出cDNA215bp，与发表的绵羊sBD-lcDNA序列完全相同。该cDNA编码以个氨基酸，其中信号肽与前片段相同，成熟肽位于前片段的羧基端，由38个氨基酸残基组成。     

犬细小病毒CPV-SHZ分离株VP2基因的克隆与序列分析

以本实验室分离鉴定犬细小病毒新疆石河子株（CPV-SHZ）的DNA为模板,根据基因库已发表CPV序列设计合成了VP2基因的1对特异引物,进行聚合酶链式反应,扩增出约1.7kb的片段,按常规方法克隆进pMD18-T载体,经EcoR I和Sal I双酶切筛选到阳性质粒。测序得到VP2全基因组序列,并登陆Genbank（EU170352）。进一步对该片段进行序列分析,结果表明：所扩增基因片段长度为1755bp,与CPV参考株毒株V154（Type2a）、LCPV-V204（Type2b）、LCPV-V139（Type 2c（a））、LCPV-V203（Type 2c（a））,其核苷酸的同源性分别为99.32%、98.75%、98.97%、98.69%,确定CPV-SHZ株基因型为2a型,将其同我国和世界其他国家主要分离株进行基因系统发生进化关系分析,结果表明,其与我国北京分离株BJ018/07亲缘关系较近。     

蓝舌病毒内蒙古分离株VP_2基因3′端序列的克隆及序列分析

内蒙古巴盟地区分离的蓝舌病毒株（ＢＴＶ－ＮＭ）经反转录ＰＣＲ，克隆、测序、进行计算机分析，证明该部分序列与呼肠孤病毒３ 型Ｌ３ 基因组片段有高度同源性，达９１％ ，与ＢＴＶ １７ＶＰ２ 基因比较，一致性为４７％     

分离与克隆中国人TPO基因片段及序列分析

应用ＲＴＰＣＲ技术从中国人胎肝细胞中分离出１个５６６ｂｐ大小的基因片段,经过克隆、限制性内切酶鉴定和序列分析证实为ＴＰＯ的ｃＤＮＡ片段．与ＧｅｎＢａｎｋ中发表的人ＴＰＯｍＲＮＡ的序列比较同源性在８２％～９９％之间,仅有２个碱基不相同,在１７５位密码子（５２３～５２５位的碱基）分别是ＣＧＧ和ＣＡＡ,即精氨酸（Ｒ）的位置上,中国人是谷胺酰氨（Ｇ）．而与测得的韩国人序列比较,在相应位置的氨基酸是相同的     

绵羊β—乳球蛋白基因调空序的分离,克隆及序列分析

根据绵羊β－乳球蛋白基因调控区ＤＮＡ序列设计了两个引物，以绵羊基因组ＤＮＡ为模板，用ＰＣＲ技术扩增，得约９００ｂｐ的ＤＮＡ片段插入到ｐＵＣ１８质粒的ＸｂａＩ／ＫｐｎＩ位点之间。     

人源温和气单胞菌溶血素基因的克隆与表达

根据GenBank报道的人源温和气单胞菌溶血素(hly)基因序列设计引物,经PCR扩增,得到大小约为1470bp的阳性产物.利用BamHⅠ,HindⅢ位点将hly基因片段克隆到pMD19-T载体,构建得到重组质粒pWT-hly,并比较所克隆基因序列的同源性.然后将该基因克隆到原核表达载体pET-28a,构建原核重组表达质粒pWET-hly,转化BL21(DE3)并进行SDS-PAGE分析.结果表明:克隆的hly基因与GenBank报道的溶血素基因同源性为96.19%;重组菌株经IPTG诱导后,hly基因得到了高效表达.     

石蒜凝集素基因的克隆

用石蒜科植物凝集素基因的保守序列为引物，利用RACE－PCR技术从石蒜幼嫩叶片中克隆出石蒜凝集素的全长cDNA，通过比较石蒜同其他石蒜科植物凝集素基因序列和推测的氨基酸序列，发现石蒜凝集素基因编码一具有信号肽的前体蛋白，石蒜凝集素同其他石蒜科植物凝集素一样为具有3个甘露糖专一结合盒的凝集素。     

葱莲凝集素基因的克隆

RACCE－PCR技术从葱莲叶片中克隆出葱莲凝集素的全长cDNA，通过比较葱莲同其它石蒜科植物的凝集素基因序列和推测的氨基酸序列，发现葱莲凝集素基因编码一具有信号肽的前体蛋白，葱莲凝集素同其它石蒜科植物凝集素一样为具有3个甘露糖专一结合盒的凝集素。     

半夏凝集素基因的克隆

利用RACE－PCR技术从半夏花序中克隆出半夏凝集素的全长cDNA,通过比较半夏同其他天南星科植物的凝集素基因序列和推测的氨基酸序列,发现半夏凝集素基因编码一具有信号肽的前体蛋白,半夏凝集素同其他天南星科植物凝集素一样,为具有3个甘露糖专一结合盒的凝集素。     

粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)几丁质酶基因克隆的筛选及序列分析

用改进方法提取粘质沙雷氏菌染色体DNA.通过PCR扩增,得到几丁质酶(chiA)基因,利用pUC19质粒构建了含有chiA基因的克隆载体 ,并转化E.coli DH5α.经测序分析,证明克隆片段与文献报道基本相同,仅在第437位碱基由C变为T.     

盐生杜氏藻cbr基因的克隆

首先对其他物种cbr／elip基因的同源序列进行相似性分析,设计一对简并引物,利用TR—PCR技术获得-250bp的片段,经克隆测序分析发现其同D．bardwail的cbr基因有67．0％的同源性,然后再以此片段为模板设计引物,通过RACE技术构建盐生杜氏藻cbr基因的全长序列．     

黑脊倒刺鲃scp3基因的克隆及其表达

为了从分子水平上研究鱼类生殖细胞发育的机制,首次从重要的经济养殖鱼类黑脊倒刺鲃中克隆出了生殖细胞减数分裂Ⅰ相关基因scp3的部分同源序列scscp3:该序列长477 bp,编码159个氨基酸.经比对发现,其编码的蛋白序列与斑马鱼scp3蛋白等具有高度的同源性.不同组织RT-PCR结果显示:scscp3基因仅在生殖细胞中...     

斑马鱼母源凝集素基因zfol的克隆和表达分析

为验证凝集素Zfol是否为母源蛋白及其具体表达模式,揭示凝集素这类来源于母体的免疫物质在鱼类胚胎发育早期的免疫保护作用并提供理论依据,克隆Zfol的基因全长进行了生物信息学分析.利用RT-PCR和Western blot分析了zfol mRNA和Zfol蛋白的时空表达.结果表明:zfol mRNA及Zfol蛋白在斑马鱼胚胎发育过程中的表达均呈动态变化.zfol mRNA在成鱼的卵巢、心脏、肝脏、肾脏、脑中表达,在精巢中未检测到表达.Zfol蛋白在精巢、心脏、脑、肝脏等组织中检测不到表达,而在肾脏中有低含量表达,在卵巢中有高含量表达.     

中国白兔IL-6基因的分子克隆及其表达研究

运用RT-PCR技术对用ConA刺激的中国白兔外周血淋巴细胞(PMBCr)进行了扩增,将纯化后的PCR产物克隆入pMD18-T中进行核苷酸序列测定.结果中国白兔IL-6基因全长726 bp,编码242个氨基酸,其中前26个氨基酸残基构成信号肽序列.与不同物种IL-6基因相比,核苷酸和推导的氨基酸序列有一定的差异.在推导的中国白兔IL-6氨基酸序列中,在108-110位存在1个潜在的N-联糖基化位点,同时存在9个Cys残基.将pTIL-6双酶切,回收目的基因片段克隆到大肠杆菌表达载体pET28a中构建了重组质粒pETIL-6,转化大肠杆菌BL21(DE3),并用IPTG进行了诱导.结果重组菌菌体裂解物经SDS-PAGE电泳可检测到相对分子量为29.5kDa的重组目的蛋白.经凝胶薄层扫描,目的蛋白表达量可占菌体蛋白的16.2%.     

纤维微菌XM-8木聚糖酶基因克隆及酶学性质

【目的】为获得可应用于木聚糖水解的酶资源,希望通过筛选分离得到能够水解木聚糖的木聚糖酶产生菌,克隆表达木聚糖酶基因并研究其酶学性质。【方法】从环境中筛选分离出可水解木聚糖的菌株,利用16SrDNA对其进行分子鉴定。扩增其木聚糖酶基因,以pET22b(+)为表达载体,构建共表达重组质粒,转化Escherichia coli BL21(DE3)进行异源表达,并对重组酶进行酶学性质研究。【结果】经16SrDNA鉴定该菌株为纤维微菌。通过PCR成功克隆到该菌的木聚糖酶基因(xyn-8a),并构建共表达质粒pET22b-xyn-8a,实现木聚糖酶Xyn-8a的活性表达。酶学性质研究表明Xyn-8a最适反应温度为60℃,最适反应pH值为6.0,只对木聚糖底物有活性;HPLC分析其水解产物以木二糖为主,还有少量的木糖和木三糖。【结论】XYN-8A在pH值为6的条件下具有较高活力,且可以催化水解反应,在生产低聚木糖方面具有一定的应用价值。