保幼激素和蜕皮激素对家蚕翅原基生长分化的影响

翅原基（Wing disc）是昆虫幼虫体内成虫原基的一种,经生长分化后最终形成成虫翅。翅原基是研究昆虫变态发育过程的一个理想系统。为探究发育过程中翅原基的生长变化,本文以家蚕翅原基为材料,通过离体和石蜡切片的方法观察了翅原基从5龄第3天至蛹期0天的形态变化,并通过注射外源蜕皮激素活性物质20E和保幼激素类似物Methoprene探究了昆虫激素对家蚕翅原基生长分化的影响。结果显示,翅原基在幼虫阶段发育缓慢,从5龄第6天起生长分化逐渐加快,且翅原基的形态发生了显著变化,原本附着于翅原基腔口处且呈团状的造血器官逐渐分散至消失,而由气管组成的翅脉逐渐形成。外源激素处理的结果显示,2μg剂量的20E可促进翅原基的生长分化,而2μg 的Methoprene抑制了翅原基的生长分化。上述结果暗示了,蜕皮激素和保幼激素共同调控了翅原基的生长分化,并最终实现了翅原基的变态发育。     

家蚕BmFKBP45基因的表达和功能分析

以家蚕（Bombyx mori）为研究对象,对果蝇DmFKBP39的同源蛋白BmFKBP45进行了表达和初步的功能分析. 对DmFKBP39和BmFKBP45进行氨基酸序列比对分析发现,它们都含有酸性氨基酸区域、碱性氨基酸区域、核定位信号及FKBP结构域. 将BmFKBP45的第2个碱性区域与核蛋白HMG2的DNA结合位点进行比对,相似性达到21%,推测BmFKBP45可通过其第2个碱性区域与DNA结合,但EMSA的结果显示重组BmFKBP45不与果蝇的JHRE1元件结合. RT-PCR和Western blot结果显示,BmFKBP45在各个发育时期的家蚕翅原基中都有表达,在蛹期的表达量逐渐下降. 激素处理实验结果显示,BmFKBP45的表达并不受20E和JH的影响. 利用Pull-down、Far-western blot和Co-IP实验鉴定出一个与BmFKBP45相互作用的蛋白Bm6G1. 这些研究结果为进一步探究BmFKBP45的功能提供了线索.     

CREB在家蚕中枢神经系统中的免疫组织化学定位

用免疫组织化学的方法,研究了CREB蛋白在家蚕中枢神经系统中的分布.结果表明,家蚕CREB蛋白在5龄幼虫期和蛹期的中枢神经系统中均有表达,主要分布在脑和神经节的胞体密集区.从5龄幼虫期到蛹期,随着发育的进行,CREB阳性细胞数逐渐减少.比较二化性品种的滞育系与非滞育系,CREB蛋白在5龄幼虫脑中的表达分布存在明显的差异,滞育系的阳性反应细胞比非滞育系多.这些结果暗示,CREB蛋白可能参与家蚕生长发育、变态的调控以及环境条件调控家蚕滞育的过程.     

家蚕非编码RNA Bm-152功能初探

Bm-152是前期研究中发现的一个在家蚕丝腺中高表达的非编码RNA.采用实时荧光定量PCR技术对Bm-152在家蚕5龄到预蛹期不同发育天数丝腺中的表达谱进行检测.同时,在个体中过表达Bm-152,检测Bm-152可能参与的信号通路.结果显示,Bm-152在家蚕5龄幼虫丝腺发育过程中无明显的变化规律,但在吐丝第1天表达量较高,随后表达量又下降.通过在血淋巴中注射2μg piggyBac[A3-EGFP-A3-Bm-152]过表达载体,48h后发现Bm-152在丝腺组织中无明显过表达,但在非丝腺组织中可实现明显过表达,且表达量上调1.66倍;蜕皮激素信号通路基因Usp在非丝腺组织中上调1.95倍,E75A在非丝腺组织中上调2.26倍,保幼激素信号通路基因Met在非丝腺组织中上调1.79倍.表明非编码RNA Bm-152可能通过蜕皮激素和保幼激素信号通路参与家蚕发育,该结果为进一步探索Bm-152的功能提供了方向.     

家蚕表皮型几丁质合成酶基因BmCHSA-2a的鉴定及其对激素的响应

文中采用5'Race方法获得了家蚕几丁质合成酶基因(BmCHSA-2a)的第1外显子(Exon 1,141 bp)和第2外显子(Exon 2a,106 bp),证明外显子2a在鳞翅目昆虫几丁质合成酶中高度保守.根据该外显子序列设计引物,分析BmCHSA-2a对激素的响应,结果表明:蜕皮激素(Ecdysone,20E)抑制BmCHSA-2a的表达;保幼激素(Juvenile Hormone,JH)间接促进其表达.根据家蚕基因组所预测的启动子序列,扩增了调控BmCHSA-2a表达的启动子,证明蜕皮激素抑制启动子活性,并存在大量蜕皮激素通路BmFTZ-F1的调控元件.对BmFTZ-F1表达调控的进一步研究表明:蜕皮激素抑制其表达.研究结果初步分析了家蚕表皮几丁质合成酶基因BmCHSA-2a可能的表达机制,为深入研究其表达调控机理及发现害虫防治新靶标提供了理论基础.     

家蚕表皮型几丁质合成酶基因BmCHSA-2a的鉴定及对激素响应

文中采用5'Race方法获得了几丁质合成酶基因（BmCHSA-2a）的第1外显子（Exon 1, 141 bp）和第2外显子（Exon 2a,106 bp）,证明外显子2a在鳞翅目昆虫几丁质合成酶中高度保守. 根据该外显子序列设计引物,分析BmCHSA-2a对激素响应分析. 结果表明蜕皮激素(Ecdysone ,20E)抑制BmCHSA-2a的表达,而保幼激素(Juvenile Hormone, JH)间接促进其表达. 根据家蚕基因组所预测的启动子序列,扩增了调控BmCHSA-2a表达的启动子,证明蜕皮激素抑制启动子活性,并存在大量蜕皮激素通路BmFTZ-F1的调控元件,对BmFTZ-F1表达调控的进一步研究表明,蜕皮激素抑制其表达. 研究结果初步分析了家蚕表皮几丁质合成酶BmCHSA-2a可能的表达机制,为深入研究其表达调控机理及发现害虫防治新靶标提供了理论基础.     

家蚕促咽侧体素受体基因克隆及发育表达

文章克隆得到家蚕(Bombyx mori)神经肽促咽侧体素受体基因(Allatotropin receptor,BommoATR),开放阅读框全长为1 254 bp,编码416个氨基酸.Bommo-ATR氨基酸序列的二级结构预测为7次穿膜蛋白,符合GPCR家族成员的典型特征.实时荧光定量PCR结果表明,家蚕脑-咽下神经节复合体中的ATR mRNA在5龄幼虫期表达量最高,其次为蛹后期,蛹前期和成虫阶段表达量最低.其中5龄幼虫第2天表达量最高,1～5 d持续维持较高的表达水平,这可能与保幼激素的合成有关.     

激素对楸子插穗内源激素含量和可溶性蛋白组成的影响

为了从分子水平上探究外源激素对楸子(Malus prunifolia)插穗中可溶性蛋白组成和内源激素含量变化的影响,利用SDS PAGE电泳技术和酶联免疫吸附分析法,研究了楸子插穗切口处的可溶性蛋白质变化和激素变化与生根的关系。结果表明:分子质量为83、72、65、52、43、39、31、28、26、22 ku的可溶性蛋白质等与生根有关。其中,分子质量为65、39、26、22 ku的蛋白是调控蛋白,当根原基分化时存在,不定根形成后即消失;分子质量为52、43、31、28 ku的蛋白是伴随不定根产生而新形成的蛋白,52 ku的蛋白是一种阻碍细胞分化的蛋白,对生根不利,其余蛋白可促进楸子插穗的生根。内源激素ZR在不定根产生过程中始终维持较高水平,而空白对照中这种趋势不明显。IAA不起主要作用,只起协同作用。GA在根原基分化时期起重要作用并与28 ku蛋白质合成有关。经过处理的插穗中ABA的含量均低于空白对照。说明不同外源激素的处理影响楸子插穗内部激素含量的变化,进而通过调控蛋白质的合成影响蛋白质的种类、数量以及出现时间的变化。     

p53基因在小鼠胚胎发育过程中的表达

以E9日龄至E14日龄昆明种正常小鼠胚胎为材料,利用质粒扩增的、地高辛标记的基因探针在组织切片上进行DNA-mRNA 分子原位杂交,研究了p53基因在小鼠胚胎发育过程中的表达.结果表明, p53基因不参与E9和E10日胚胎发育中的器官原基形成,参与器官的进一步分化成熟过程.这些器官主要有眼、脑、心、肺、脊柱和面颌骨,肝组织的发育与其无关; p53基因一方面参与胚胎发育中的细胞周期调控,另一方面也参与了某些与细胞周期无关的过程;不同的器官有不同的细胞周期调控机制.     

棕色田鼠睾丸和附睾胚后发育中的雌二醇表达

应用免疫组织化学方法研究了产后1日龄、10日龄、25日龄、45日龄及60日龄(成体)5个发育阶段的棕色田鼠(Microtus mandarinus)睾丸和附睾中雌二醇(estradiol,E2)的表达.结果表明:1日龄,睾丸生殖母细胞有E2阳性表达.10日龄,生殖母细胞E2表达减弱(P<0.05).25日龄,E2表达主要见于精子细胞.45日龄,精母细胞和精子细胞中有E2表达.60日龄,精原细胞、精母细胞、精子细胞及精子中均有E2表达,精母细胞和精子细胞表达较强,精原细胞表达较弱.在胚后发育过程中,1日龄和10日龄间质区细胞的E2表达最强,25日龄和45日龄E2表达减弱,60日龄E2表达最弱(P<0.05).1日龄至60日龄附睾上皮细胞和连接组织均有E2表达,60日龄附睾管内有大量精子,且有明显的E2表达.这些结果说明,棕色田鼠从出生到性成熟过程中,生殖细胞和间质细胞有E2生成.在精子发生的各阶段,雌激素通过其受体可能对生精细胞的分化和增殖有直接调控作用,对间质细胞的发育也存在着调节作用.同时,附睾的发育和精子的成熟也受到雌激素的调节.     

人工饲料育家蚕/杆状病毒表达猪瘟病毒囊膜糖蛋白E2基因

以重组病毒Bm-BacPAK6-E2接种全龄人工饲料育及5龄桑叶育家蚕皓月×菁松幼虫、蛹,观察重组病毒的感染发病情况,调查病蚕、蛹的采血量并进行SDS-PAGE分析.结果表明,全龄人工饲料育家蚕接种重组病毒的成功率、采血量等指标均与5龄桑叶育相近,SDS-PAGE蛋白质电泳在家蚕幼虫、蛹血淋巴中均检测到1条与目的蛋白理论分子量(63 kD)相符的特异性蛋白条带,初步认为是重组病毒Bm-BacPAK6-E2的融合表达产物.     

Immune response in cattle inoculated with the recombinant complete polyprotein of foot-and-mouth disease virus from Bombyx mori larvae

The intact open reading frame (ORF) of foot-and-mouth disease virus (FMDV) Asia I/XJ strain was am- plified by RT-PCR and inserted into the transfer vector pVL1393 to generate plasmid pVL-ORF. Bm-N cells were transfected with pVL-ORF and linearized Bm-BacPAK6 DNA, and the recombinant silkworm baculovirus Bm-ORF containing the full ORF of FMDV was obtained. The results of indirect im- munofluorescence assay (IFA) showed that Bm-ORF could be expressed efficiently in Bm-N cell. After inoculating the early 5th instar larvae of silkworm, the polyprotein of FMDV could be detected by sandwich ELISA and empty capsid-like particles could be observed under the electron microscope. Expression products from silkworm were used as the antigen to immunize the cattle. The specific an- tibody was induced in all vaccinated animals. The immunized cattle were challenged with the virulent FMDV Asia I/XJ strain, two of the four cattle were completely protected and clinical symptoms were alleviated and delayed in the others. The results suggest that this strategy might be used to develop the new subunit FMDV vaccine.     

Synthesis dynamic and developmental profile of prothoracicotropic hormone between diapause-and nondiapause-destined individuals in Helicoverpa armigera

Biosynthesis and secretion of prothoracicotropic hormone (PTTH) of diapause-and nondiapause-destined individuals in Helicoverpa armigera were studied using whole-mount immunocytochemistry and enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). The immunocytochemistry revealed that PTTH is expressed in two pairs of lateral neurosecretory cells of the brain. The presence of immunoreactivity has not significant difference between the brains of the diapause-and nondiapause-destined 6th instar larvae. However,the obvious differences of expressional pattern from day 4 pupae were observed be-tween the two types. PTTH titers in hemolymph from the 6th instar larvae to pharate adults were measured by the ELISA. Although there were similar titer changes between the two types of individuals at the larval stage,a significant difference from developmental expression was detected at the pupal stage,suggesting that the expression and secretion of PTTH does play a crucial role in regulation of pupal diapause of H. armigera.     

His-猪生长激素融合基因在Bm-N细胞和蚕体内的表达与纯化

用构建的带有His—Tag pgh融合基因的重组杆状病毒Bm—BacPAK6—pgh研究了Bm—BacPAK6—pgh在家蚕细胞(Bm—N)和蚕体内的表达，并对蚕体表达产物进行了纯化．SDS—PAGE电泳分析显示，重组病毒Bin—BacPAK6—pgh在Bin—N细胞、蚕体中得到了融合表达，Western blot分析表明，Bm—N细胞、蚕体中表达的融合蛋白与大肠杆菌表达的猪生长激素具有相同的抗原性．Bm-BacPAK6-pgh在Bin—N细胞内的表达始于24h，而蚕体中的表达始于72h，二者的表达峰分别在96h和120h．经40％饱和度硫酸铵盐析和Ni—NTA Agarose亲和柱二步纯化可获得SDS—PA(正电泳纯的具有抗原性的重组猪生长激素融合蛋白。     

蜘蛛拖牵丝蛋白基因转家蚕表达质粒的构建

利用DNA重组技术对络新妇蛛(Nephila clavipes)拖牵丝蛋白基因MaSp1高度重复序列进行多次重组,人工构建成1.6 kb的蜘蛛拖牵丝蛋白人工基因Sil-E,DNA序列分析证明了人工基因序列的正确性.将家蚕L链基因启动子片段、L链cDNA、L链基因终止子融合在一起,构建成丝腺特异性表达单元.再与Sil-E融合构建成蜘蛛拖牵丝蛋白基因家蚕丝腺特异表达单元.将该表达单元克隆到转座子piggyBac的转基因载体中,获得了蜘蛛拖牵丝蛋白转基因表达载体.采用显微注射法将其与辅助质粒共导入到家蚕蚕卵中.筛选转基因阳性个体,经PCR和Southern杂交鉴定,结果表明目的基因整合到家蚕基因组中,为进一步研究家蚕作为生物反应器表达蜘蛛拖牵丝蛋白基因奠定了基础.     

Study on the interaction between Jak3 and IL-2R γ using the yeast two-hybrid system

Both interleukin-2 (IL-2) receptor γ subunit and non-receptor tyrosine kinase Jak3 play important roles in IL-2 physiological functions. Jak3 has been known to bind IL-2Rγ and the interaction is very important for IL-2 signaling. In order to find the domains directly involved in the interaction between IL-2Rγ and Jak3, various deletion mutants have been constructed and their interaction has been studied using the yeast two-hybrid system. Results show that the JH3-JH7 region of Jak3 N-terminal can bind to intracellular domain of IL-2Ry directly and the intact structure of JH3-JH7 region is necessary for this combination. In addition, the region from 305 to 317 amino acid residues near the C-terminal of IL-2Ry plays a critical role in this interaction .