抗冻蛋白的作用机制及基因工程研究进展抗冻蛋白的作用机制及基因工程研究进展汪少芸

分析了抗冻蛋白的作用机制及基因工程的研究进展.抗冻蛋白是一类具有热滞效应、冰晶形态效应和重结晶抑制效应的蛋白质.近些年的工作主要集中在该类蛋白质抗冻机制及基因工程的研究上.抗冻蛋白具有广泛的应用前景,它不但可以应用于食物的冷鲜贮存及移植器官的低温保存,还可通过转基因提高经济作物的抗冻能力.     

抗冻蛋白基因定向突变及其抗冻关系的研究

为探讨抗冻蛋白的抗冻机制,根据抗冻活力较高的肝型抗冻蛋白的氨基酸组成,改造皮肤型抗冻蛋白基因,使皮肤型抗冻蛋白基因的10位氨基酸－丙氨酸（A）改造成天冬氨酸（D）,方法：合成一段含有突变位点的DNA片段,用其取代野生型DNA上相对应的片段,DNA测序法筛选阳性克隆并表达该蛋白,Western-blot法、氨基酸组成分析法、及质谱法鉴定表达蛋白,测定突变后抗冻蛋白的的活力并与野生型比较,以期揭示抗冻蛋白的抗冻机制。     

抗冻蛋白活性的吸附动力学模型

根据抗冻蛋白溶液中抗冻蛋白分子与冰晶表面相耳作用特点，提出抗冻蛋白与冰晶表面相互作用模型。进而，利用饱和分数与抗冻活性之间的关系，给出抗冻活性与抗冻蛋白浓度的理论关系。根据此关系做出了与实验数据符合较好的抗冻活性与抗冻蛋白浓度关系的理论曲线。另外，对抗冻蛋白分子与冰晶表面相互作用的特点作了进一步的讨论．     

鱼源Ⅲ型抗冻蛋白的生物学活性

为了通过细菌低温保护实验测定鱼源Ⅲ型抗冻蛋白（AFPⅢ）对大肠杆菌的低温保护效果,利用前期构建的原核表达质粒pET32a（＋）-AFPⅢ转化大肠杆菌,目的蛋白以融合his标签的形式在大肠杆菌中表达,经NI柱亲和层析得到较高纯度的AFPⅢ-his融合蛋白。细菌抗冻实验的结果表明,外加一定浓度范围内的纯化的AFPⅢ融合蛋白对细菌有明显保护作用,但是抗冻蛋白的浓度对细菌的保护力不成一致的线性关系。鱼源Ⅲ型抗冻蛋白的浓度在50μg／mL时抗冻效果最好,并且随着温度的下降,抗冻蛋白对细菌的保护能力与Glycerol对细菌的保护能力的差距逐渐减少,在-80℃时基本可以代替甘油用于菌种保存。     

冬蝶鱼皮肤型抗冻蛋白的克隆及表达

冬蝶鱼皮肤型抗冻蛋白（ｗ ｆｓ Ａ Ｆ Ｐ）的克隆和表达,是研究抗冻蛋白抗冻机制的重要步骤之一,有助于揭示抗冻蛋白分子结构与活力的关系．用 Ｐ Ｃ Ｒ 法获得 ｗ ｆｓ Ａ Ｆ Ｐ 基因片段,构建了分泌型表达载体 Ｐｌａｃ Ｉ Ｑｐａｒ８ｗ ｆｓ Ａ Ｆ Ｐ．用 Ｗ ｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔ 法测其表达水平,氨基酸组成分析及质谱分析证明表达的蛋白与天然蛋白完全一致,并具有天然蛋白相同的活力．     

抗冻蛋白基因转化植物的研究展望

重新评估了用美洲拟鲽抗冻蛋白基因转化烟草的研究，认为植物耐寒性状的提高与转基因植物中冻抗蛋白含量呈正相关是转基因植物成功的关键性指标。美洲拟鲽抗冻蛋白的空间结构与冷冻诱导蛋白相似而且都保护细胞膜免受冻害，因而提出了用冷诱导蛋白调节元的顺式作用元件和反式作用因子的调控序列来控制抗冻蛋白基因在植物中冷诱导表达的思路。     

抗冻蛋白的研究进展及其在食品工业中的应用

抗冻蛋白是一类具有热滞效应、冰晶形态效应和重结晶抑制效应的蛋白质,因其特殊的结构和功能,抗冻蛋白引起了研究人员的极大兴趣.探讨了近年来抗冻蛋白的研究进展,介绍了目前已知的抗冻蛋白的来源、特性、测定方法、基因结构及在食品工业中的应用.抗冻蛋白对冷冻食品有显著的品质改良功能,是未来冷冻食品工业中极具潜力的抗冻添加剂.     

抗冻蛋白溶液中界面吸附的元胞自动机模型

在分析抗冻蛋白溶液中冰晶生长的实验结果和抗冻蛋白分子结构的基础上，提出了一个抗冻蛋白溶液中界面吸附的元胞自动机模型，并用计算机对模型进行了数值模拟，得出冰晶界面层厚度与系统中水分子吸附量以及抗冻蛋白浓度的关系，数值模拟的结果和实验结果附合较好。模型对于指导实验上定量测定冰晶界面层的吸附情况和解释实验结果的机理有一定意义。     

抗冻蛋白及其对冰晶生长的影响

抗冻蛋白具有特殊的热迟滞性质，即其冰点低于熔点，且能抑制冰晶的生长．本文综述了在耐寒鱼、昆虫体内以及最近二三年在植物、真菌、细菌等生物中发现的抗冻蛋白，分析其结构及其对冰晶生长的影响，并寻求抗冻蛋白在细胞、生物组织的低温保存中可能的应用途径．     

冬鲽鱼抗冻蛋白基因的人工合成

合成适合在棉花中表达的冬鲽鱼抗冻蛋白（Winter flounder antifreeze protein,Wf-AFP）基因.参照冬鲽鱼抗冻蛋白的氨基酸序列及棉花偏爱的密码子,重新设计适合在棉花中表达的Wf-AFP基因序列;根据此序列设计6条寡核苷酸引物,通过PCR方法将其拼接成完整的基因;克隆到pUCm-T载体上,转化大肠杆菌DH5α,抽提重组子进行酶切鉴定及序列分析.结果表明合成的Wf-AFP基因序列与设计方案完全相符,通过PCR介导的基因合成方法成功获得了适合在棉花中表达的冬鲽鱼抗冻蛋白基因.     

复合防冻剂的防冻机理及施工要求

在建筑工程中,混凝土是使用最广泛的一种材料,混凝土的耐久性受到人们的普遍关注,其中冻害性是影响混凝土耐久性的一个最重要的因素。改善并开发抗冻性能良好的混凝土具有非常重大的经济效益与社会效益。而采用掺复合防冻剂混凝土具有施工简便、节能、节约混凝土冬施费用,提高混凝土冬施质量等优点,它不仅能够降低混凝土中液相冰点,同时还具有促凝、早强和减水作用。     

极区鱼的抗冷冻机理

鱼抗冷冻蛋白和抗冷冻糖蛋白有抗冻功能，本文阐述并讨论了各种抗冻机理学说。本文在预测了ＡＦＰⅠ、ＡＦＰⅡ和ＡＦＰⅢ的二级结构并分析了ＡＦＰ三级结构的特点基础上，计算了抗冷冻蛋白的热滞，得出了与实验相符结论．     

印楝Azadirachta Indica A.Juss的冷驯化与抗冻蛋白的研究

采用木本植物材料——印楝,通过组织培养建立快繁体系,然后对其进行冷驯化处理,并分析检测印楝植物体内抗冻蛋白.主要结果如下:①冷驯化处理后印楝的总蛋白一些表现为量的增加同时会有新的蛋白产生.但脱驯化或处理时间过长时,抗冻蛋白在量的表达上会有逐渐减少或消失的现象.②在对印楝的冷驯化中,发现不同的温度处理后蛋白稳定存在的时间不同.抗冻蛋白出现的最早时期为5℃处理2周左右,印楝能耐受的稳定最低温为5℃,所持续的最长时间约为20d.在0℃低温处理后,虽然在处理初期(0～15d)也有抗冻蛋白的产生,但随处理时间的延长,这种差异逐渐减少,在处理30d时完全消失.③得到了分离纯化的抗冻蛋白,其相对分子质量约为3.6×104.     

冬鲽抗冻多肽的分子生物学

前文“鱼类抗冻多肽的结构与功能”已介绍了对抗冻体的存在、分布、分类以及结构和功能的研究工作,本文将着重冬鲽抗冻多肽(Winter Flounder AFP)的分子生物学方面作介绍。冬鲽鱼AFP作为探讨真核生物的分子生物学模型有下列优点: 1.该多肽分子量小,约3300。只含有9种不同的氨基酸,其中丙氨酸占60％。     

TMU小黑鼠遗传纯度的生化标记基因检测

本文采用同功酶及异构蛋白醋酸纤维素膜电泳法,对分布在TMU小黑鼠9个染色体上的13个生化基因位点进行检测,以观察其在生化基因位点上的遗传纯度及遗传基因分布。结果表明,TMU小黑鼠在检测位点上的等位基因全部为纯合子。进而从生化标记基因的遗传纯度方面证实该品系动物已达到近交系要求。     

抗冻肽基因在植物表达载体中的构建

植物表达载体P^Bin438经HindⅡ和EcoPⅠ双酶切,回收其HindⅡ－BmaHⅠ-Sal-EcoRⅠ片段和P^UC19HⅢ-EcoRI片段连接,构建成载体记为P^UC38。将含AFP基因的克隆经BamHI,XhoⅠ双酶切,得到的BamHI-AFP-XhoⅠ片段装入P^UC38BanHI-SalⅠ位点,克隆AFP基因。然后再用HindⅢ、EoR1双酶切AFP基因,插入P^Uin438的HindⅢ-EcoRⅠ位点,进而构建成带有AFP基因的植物表达载体,为进一步研究AFP基因在植物中表达奠定了基础。     

植物热激蛋白研究进展

热激蛋白是一类在有机体受到高温等逆境刺激后大量表达的蛋白,主要参与生物体内新生肽的运输、折叠、组装、定位以及变性蛋白的复性和降解,是细胞内含量最丰富的蛋白质之一,已成为当今分子生物学、蛋白质生物化学和植物抗逆生理学的一个重要研究内容.论述了植物热激蛋白的研究概况、合成及分布、生物学功能、基因表达调控,提出植物热激蛋白今后的研究方向。