Construction and<Emphasis Type="Italic">in vitro</Emphasis> study of an E1B-defective adenovirus

An E1B-defective adenovirus named rl/Ad was constructed by homologous recombination.The construction,selection and propagation of recombinant virus was done in the human embryonic kidney 293 cells (HEK293).The in vitro study demonstrated that the recombinant virus has the ability to replicate in and lyse some p53-deficient human tumor cells such as the human glioblastoma tumor cells (U251) and human bladder tumer cells (EJ) but not in the normal cells with functional p53 such as the human fibroblast cells (MRC-5).Also,based on the cytopathic effect (CPE),it was demonstrated that the U251 cells were more sensitive to the infection of rl/Ad than that of EJ cells under identical conditions.In this paper,it was found that rl/Ad could be very useful in studying the in vitro selective replication of E1B-defective adenovirus.This may help to determine the safety of using any E1B-defective adenoviruses in cancer gene therapy.     

hPNAS-4腺病毒载体的构建及其体外抗肿瘤作用

[摘要] 目的：构建携带人的凋亡相关新基因PNAS-4(hPNAS-4)的重组腺病毒,并观察其感染人肺癌A549细胞所引起的hPNAS-4过表达对体外肿瘤细胞凋亡的影响。方法：用RT-PCR从293A细胞中克隆hPNAS-4编码区cDNA,将其酶切后连接至pENTR11载体上,再通过pENTR11与腺病毒骨架载体pAd/CMV/V5-DEST之间的同源重组作用将hPNAS-4基因片段重组至pAd/CMV/V5-DEST上,最后经293细胞的包装扩增后得到携带hPNAS-4基因的重组腺病毒;将重组腺病毒体外感染人肺癌A549细胞;用RT-PCR检测感染细胞中hPNAS-4的过表达情况;通过MTT、流式细胞术及DNA Ladder分别检测感染细胞的增殖与凋亡情况。结果：从293A细胞中中克隆到hPNAS-4全长cDNA并成功构建腺病毒表达载体Ad-hPNAS-4,经测定其滴度为：2.4×108 pfu/ml,感染人肺癌A549细胞后：经RT-PCR测得其mRNA表达明显上调,MTT检测结果为细胞增殖受到明显抑制,流式细胞术测得细胞凋亡率明显升高,琼脂糖凝胶电泳显示其基因组DNA有明显的梯状条带（DNA ladder）;结论：hPNAS-4腺病毒载体感染人肺癌A549细胞后,发现hPNAS-4过表达对肿瘤细胞的生长有明显的抑制和诱导凋亡作用,为今后研究其分子机制以及hPNAS-4腺病毒载体应用于肿瘤动物实验和肿瘤基因治疗提供实验资料。     

携带p53基因重组腺病毒载体的构建

将pCMVp53重组转移载体经BamHI和NheI酶切,得到p53基因cDNA,然后将cDNA片段克隆到转移载体pCMV5GFP,使其受CMV5启动子的调控,获得pCMV5p53重组转移载体.用该线状重组转移载体与腺病毒右臂DNA经磷酸钙共转染293细胞获得重组腺病毒,经酶联免疫吸附法(ELISA)测定p53蛋白含量,证明外源p53基因在含重组腺病毒的293细胞中得到表达.     

重组腺病毒介导RNA干扰人DLK1基因表达的研究

构建抑制人DLK1基因表达的重组腺病毒载体,利用腺病毒载体介导的RNA干扰技术评价其在肝癌细胞株中的基因沉默效应.将针对人DLK1基因的RNAi寡核苷酸序列,连接到腺病毒穿梭质粒中,在含有腺病毒骨架质粒pAdEasy-1的大肠杆菌BJ5183内进行同源重组.重组腺病毒载体在HEK-293细胞中包装扩增,得到高滴度的重组腺病毒.通过绿色荧光蛋白示踪腺病毒的感染效果,并通过荧光实时RT-PCR,western blot的方法证实重组腺病毒能够显著抑制DLK1基因在肝癌细胞株中的表达.     

腺病毒介导MTS1的抑癌作用

人多肿瘤抑制因子（MTS1）是一个抑瘤基因,在许多原发性肿瘤及细胞系中都发现了它的突变,有潜在应用价值。由于腺病毒独特的性质,它介导的肿瘤基因置换疗法,受到了愈来愈多的应用与关注。人癌胚抗原启动子能指导组织特异性表达。将癌胚抗原启动子置于MTS1基因上游,并在下游加poly A化信号,通过穿梭质粒pΔE1SP1A在人胚肾细胞HEK 293中与腺病毒载体pBHG11进行同源重组,插入腺病毒E1区。获得的重组病毒粒子作用于人乳腺癌细胞系MCF7,初步表明重组腺病毒能抑制MCF7的生长。     

用于骨移植的hCbfa1重组腺病毒载体的构建

克隆hCbfa1的cDNA基因,构建其重组腺病毒载体,以用于研究hCbfa1腺病毒载体在人造骨移植中的作用.将hCbfa1的cDNA目的片段插入腺病毒柯氏质粒PAxCAwt中,再将此质粒与腺病毒DNA末端蛋白复合物共转染293个细胞,通过同源重组构建hCbfa1重组腺病毒载体.重组得到的阳性克隆经酶切、测序鉴定正确,包装纯化后,检测得病毒滴度为2×109PFU/mL,从而成功地构建了hCbfa1重组腺病毒载体,为下一步应用到人造骨移植的转基因治疗打下了基础.     

汉滩病毒G1重组腺病毒的表达及其免疫学特性研究

将汉滩病毒(HTNV)囊膜糖蛋白G1重组腺病毒(Adeno-G1)感染VeroE6细胞,用IFA法检测其表达产物;并进一步将其免疫Balb/c小鼠。结果可检测到HTNV糖蛋白G1在VeroE6细胞中表达;用该重组腺病毒免疫小鼠,结果表明免疫小鼠体内可诱导产生抗汉滩病毒G1特异性抗体,同时微量细胞培养中和实验结果表明重组腺病毒还可刺激机体产生低水平的中和抗体,但淋巴细胞增殖反应不明显。说明Adeno-G1免疫小鼠后,主要刺激机体产生特异性的抗HTNV体液免疫应答,但刺激机体产生特异性的细胞免疫应答不明显,为HTNV基因工程疫苗的研究提供了实验基础。     

血管生成素-1基因治疗兔心肌梗塞的实验观察

探讨血管生成素_1(Ang1)基因经重组腺病毒介导转移促进心肌缺血区血管形成的作用 .应用共转染 2 93细胞 ,制备纯化Ang1重组腺病毒及LacZ重组腺病毒 .将Ang1重组腺病毒及LacZ重组腺病毒直接注射感染兔冠状动脉结扎后缺血心肌细胞 ,分别应用RT_PCR方法及X_gal染色测定外源基因在转导心肌中的表达 ,用免疫组化及冠状动脉造影方法观察缺血心肌内血管生长及侧支循环形成的情况 ,并用心脏超声检查观测了注射Ang1重组腺病毒后心功能变化 .结果显示重组腺病毒直接注射感染兔缺血心肌后能有效表达目的基因 ,X_gal染色显示LacZ基因转移后第 3、7、14、2 8d注射部位心肌均见蓝染 ,尤以 7d明显 ,RT_PCR测定提示Ang1基因在转移后第 3d心肌中即有表达 ,7、14d仍呈阳性表达 .转移 2 8d后新生毛细血管密度及侧支循环形成明显高于对照组 (P <0 .0 1) .心肌梗塞发生后各组的心功能随时间延长均有所改善但 14d内各组间无明显差异 ,2 8d后Ang1组改善幅度明显高于对照组 (P <0 .0 1) .本实验表明腺病毒介导的Ang1基因在兔缺血心肌中能有效表达 ,促进新生血管形成 ,改善心脏功能 .     

nRF24E1无线组网及其安全技术研究

无线通信已经成为当今社会的一项热点技术,并被广泛应用,它所构建的无线网络也迅速普及。文章以中小型餐饮企业无线点菜系统为例,提出了一种基于nRF24E1芯片的无线组网架构方案,并结合网络安全技术进行了细致的研究.     

犬腺病毒2型抗原的制备及间接ELISA的建立

用MDCK细胞增殖犬腺病毒2型弱毒疫苗株,病毒培养上清液经差速离心和酒石酸钾密度梯度离心浓缩、纯化后作为诊断抗原,建立了犬腺病毒2型抗体检测的间接ELISA。确定最佳抗原包被量为0.168μg/孔,待检血清最佳稀释倍数为1:100,作用时间为60 min,羊抗犬酶标抗体稀释倍数为1:2000,作用时间为60 min,底物作用时间为37℃,10 min。判定标准为S/P值≥0.351者判为阳性,S/P值≤0.318者判为阴性。该抗原不与犬瘟热病毒、犬细小病毒、犬波特氏杆菌等3种犬常见传染病的阳性血清反应,具有良好的特异性;批内、批间重复试验,变异系数小于15%,显示具有较好的重复性;检测血清样品56份,与病毒中和试验结果比对的符合率为93.75%。本研究结果为实现犬腺病毒感染监测,进行犬腺病毒流行病学调查提供了一种简便的血清学诊断方法。     

腺病毒介导的bFGF基因对大鼠大脑中动脉闭塞模型的作用

采用改良的Zea Longa法制备大鼠脑缺血模型,研究腺病毒介导的bFGF的基因治疗对大鼠大脑中动脉闭塞(MCAO) 模型的治疗作用及脑血管发生的影响,将30只SD大鼠随机分为假手术组、空载体组（Ad-null组）和治疗组（Ad-bFGF组）,于造模成功后24h尾静脉给药.检测实验各组脑组织含水率的变化,通过核磁共振的和免疫组化分别检测实验各组大脑梗死体积和血管发生的变化.结果发现治疗组大鼠脑组织含水率和脑梗死面积明显小于空载体组,脑血管密度显著高于空载组.说明腺病毒介导的bFGF基因卡显著减小脑组织含水率和脑梗死面积,促进脑部血管发生,为缺血性脑卒中的基因治疗提供了新的途径.     

GFP标记的GDNF重组腺病毒载体的构建和体内外表达

通过构建绿色荧光蛋白(GFP)和胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)共表达的腺病毒载体,讨论其在治疗脊髓和脑有关神经系统疾病的潜在应用价值,了解腺病毒载体在大鼠体内的分布及在体外分泌外源基因产物能力,并对其生物安全性作了初步考察,为GDNF重组腺病毒载体在临床和基础研究中的应用作了一定准备．     

Construction and expression of inverted configuration of retroviral vector containing intron 1 of hFIX

Intron was found to play an important role in improving gene expression. To improve the human factor IX(hFIX) expression level in hemophilia B gene therapy study, the retroviral vector containing intron 1 of hFIX gene was constructed in forwarded configuration, but the intron 1 was found spliced in virus particles by RT_PCR detection. So the inverted configuration vector G1NaPAi′IX was suggested and constructed on the basis of SNMBAIXm and transfected into PA317. Then C2C12 cells were transfected using the above virus supernatant and the G418_resistant clones were selected. PCR and RT_PCR detection found that intron 1 structure existed in C2C12 clones and retroviral particles. And the expression level of inverted vector was 3 times higher than that of forwarded vector. These results showed that the inverted configuration vector was in deed able to avoid splicing of intron 1 during the process of retroviral packaging and improved the expression level of hFIX protein.     

碲镉汞吸收缘以上E1和E2峰的指认

用紫外可见分光光度计测量了碲镉汞样品的反射谱,在基本反射区有两个主要反射峰Ｅ１和Ｅ２,Ｅ１峰分裂为双峰结构．利用电子跃迁的量子理论,指认Ｅ１峰为〈１１１〉方向Λ４,５→Λ６的跃迁;Ｅ１＋Δ１峰为〈１１１〉方向Λ６→Λ６的跃迁;Ｅ２峰为〈１００〉方向Ｘ７→Ｘ６的跃迁．计算结果与实验结果相符     

鸡腺病毒内蒙古分离株六邻体蛋白基因片段的合成和分子克隆

根据鸡１０型腺病毒以及人２、５、４０、４１型腺病毒、牛３型、鼠１型腺病毒六邻体蛋白基因序列，选择保守区，设计和合成一对引物，以鸡腺病毒内蒙古分离株基因组ＤＮＡ为模板，进行聚合酶链反应（ＰＣＲ）扩增得到预期大小的０．５５ｋｂＤＮＡ片段．将此ＤＮＡ片段克隆于ｐＵＣ１９的ＳｍａＩ位点，筛选重组质粒，进行限制酶切分析和ＰＣＲ检测，得到含有六邻体蛋白基因片段的重组质粒，为进一步开展此病毒分子生物学研究和分子生物学诊断技术的建立创造了条件     

弹性蛋白酶保护因子--Elafin结构基因腺病毒载体穿梭质粒的构建、鉴定及表达

构建能表达弹性蛋白酶保护因子———elafin基因腺病毒表达载体的穿梭质粒,为进一步包装能高效表达结构蛋白的腺病毒载体做准备.以含有elafin基因的真核质粒pEGFP-N1-Elafin为模板,PCR扩增elafin基因,PCR产物以SalⅠ、EcoRⅤ双酶切,定向插入到腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV中CMV启动子下游SalⅠ与EcoRⅤ位点之间,获得重组腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV-Elafin,通过SalⅠ及EcoRⅤ双酶切、PCR及插入片段序列测定对该质粒进行鉴定,将pAdTrack-CMV-Elafin转染293细胞,以RT-PCR及Western-Blot检测其在293细胞中的瞬时表达.结果表明:双酶切、PCR及测序鉴定证实,pAdTrack-CMV-Elafin穿梭质粒的插入片段为elafin基因,用pAdTrack-CMV-Elafin穿梭质粒转染293细胞后可见绿色荧光蛋白的表达,RT-PCR和Western-blotting表明其可在293细胞中瞬时表达.     

ING4及IL-24双基因共表达腺病毒载体对MG-63人骨肉瘤细胞体外抑癌增效作用研究

目的用人肿瘤生长抑制因子(mING4)及人白介素24(IL-24)基因构建腺病毒双基因共表达载体(Ad-ING4-IL-24),并设Ad-ING4和Ad-IL-24单基因对照,研究双基因共表达载体对MG-63人骨肉瘤细胞体外抑癌增效作用.方法首先将已构建成功的Ad-ING4-IL-24,Ad-ING4及Ad-IL-24腺病毒感染QBI-293A细胞,经多轮扩增后获得高滴度的病毒子,测病毒效价后分别以100 MOI剂量感染MG-63细胞,用荧光显微镜、RT-PCR法检测ING-4及IL-24在MG-63细胞中的转录和表达;MTT法检测ING-4及IL-24基因表达对MG-63细胞的生长抑制效应;半定量RT-PCR法检测ING4及IL-24基因表达对MG-63细胞中的Bcl-2,Bax,Caspase3,p21,CD34等相关基因表达的影响.结果获得了高滴度的重组腺病毒Ad-ING4-IL-24,Ad-ING4,Ad-IL-24和Ad-GFP;治疗后MG-63细胞中ING-4及IL-24双基因表达对MG-63细胞增殖有明显抑制作用,ING-4及IL-24基因表达可通过上调细胞中Bax,Caspase3,p21和下调Bcl-2,CD34基因表达诱导细胞凋亡.在病毒子剂量为100 MOI时,Ad-ING4-IL-24对MG-63人骨肉瘤细胞抑制作用比对Ad-ING4和Ad-IL-24抑制效果更为显著.结论腺病毒介导的ING4或/和IL-24基因可明显抑制MG-63人骨肉瘤细胞的生长,且Ad-ING4-IL-24双基因比Ad-ING4和Ad-IL-24单基因的抑制效果更为显著,该现象可能是通过改变Bcl-2,Bax,Caspase3,p21,CD34基因表达水平来发挥抗肿瘤作用的.     

路由器中的E1接口设计

提出了在路由器设计中的E1接口的设计方案,对硬件连接和物理层芯片PEB2260 -N、MPC860的SCC3、TSA进行了介绍.为了实现PEB2260-N和MPC860的正确数据交换、帧的完全同步,对其中的寄存器进行了正确的设置.PEB2260-N采用双帧模式透明传输,MPC860采用HDLC数据传输,经过底层的驱动,基本完成数据的收发.     

pACT E3质粒的构建及其在转基因烟草中的表达

将1个从棉花中分离的新的启动子ACT E3插入质粒pBI101,ACT E3与GUS基因融合，构建成pACT E3表达载体。通过农杆菌介导转化法将ACT E3/GUS融合基因导入烟草。GUS组织化学染色分析表明，在ACT E3启动子控制下，GUS基因仅在叶片及茎等组织中特异表达。     

猪口蹄疫病毒基因工程疫苗的工程菌的发酵研究

在猪口蹄疫病毒活性肽ＶＰ１融合蛋白基因工程菌Ｅ．ｃｏｌｉＣ５００构建成功的基础上，研究了Ｃ５００的质粒稳定性，Ｃ５００在４种不同培养基中的生长曲线，以及不同种龄，接种量，装液量，碳源氮源对菌体生长的影响。