松材线虫与拟松材线虫RAPD检测技术

采用RAPD技术对松材线虫和拟松材线虫进行了检测研究,从140个随机引物中筛选出引物OPK09与引物组合OPC18 OPN18。引物OPK09对12个松材线虫株系扩增出一条约2400bp左右的特异片段,引物组合OPC18 OPN18对10个拟松材线虫株系扩增出一条970bp左右的特异片段。实验表明,引物OPK09与引物组合OPC18 OPN18具有特异性强、灵敏度高的优点。用这两组引物可以快速、准确鉴定松材线虫和拟松材线虫。     

“松材线虫SCAR标记与系列分子检测技术及试剂盒研制”项目通过鉴定

2006年5月，我校森林资源与环境学院叶建仁教授主持完成的“松材线虫SCAR标记与系列分子检测技术及试剂盒研制”通过了江苏省科技厅组织的科技成果鉴定。该项研究对松材线虫与拟松材线虫特异片段进行了系统筛选，共获得了7个松材线虫DNA特异片段与5个拟松材线虫DNA特异片段，为松材线虫与拟松材线虫的分子鉴定奠定了基础。首次将2个松材线虫与2个拟松材线虫的DNA特异片段成功转化为SCAR标记，丰富了松材线虫与拟松材线虫分子标记方法。首次采用SCAR标记方法成功构建了松材线虫检测试剂盒，PCR检测过程仅需2．2h。首次成功标记了一个可用于检测松材线虫的非放射性探针DlG—F2／R1。用该探针对线虫基因组DNA点杂交，松材线虫均表现有较强的杂交信号，而拟松材线虫、霍夫曼尼伞滑刃线虫、大核滑刃线虫、长尾属线虫等均无杂交信号。成功设计、合成了TaqMan探针与其配套的引物对F11／R11。     

应用PCR-RFLP技术鉴别松材线虫与拟松材线虫

应用PCR—RFLP技术分析松材线虫与拟松材线虫之间的差异。实验扩增出松材线虫rDNA—ITS区片段长度约为890bp，拟松材线虫rDNA—ITS区片段长度约为930bp。用5种限制性内切酶对两种线虫的ITS区扩增产物进行酶切，结果表明：（1）DraⅠ酶切松材线虫群体均产生两个长度约510bp和380bp的片段，而拟松材线虫均不能被DraⅠ酶切；（2）所有的松材线虫群体与拟松材线虫群体的ITS区扩增产物均不能被ApaⅠ酶切；（3）用MspⅠ酶切松材线虫群体，除GZ02不能够被酶切外，其余样本能够产生两条长度分别为530bp和360bp的谱带。拟松材线虫群体，都能产生3条一致的亮带，长度分别为340bp、290bp、180bp；（4）所有松材线虫样本均不能被SalⅠ酶切，而拟松材线虫群体均能够被酶切为两个720bp和220bp的片段；（5）XhoⅠ酶切松材线虫ITS区为两条大小分别为520bp和370bp的谱带。而拟松材线虫产生两条大小分别为530bp和400bp的谱带。因此，内切酶DraⅠ、SalⅠ可以用于检测松材线虫与拟松材线虫。MspⅠ、ApaⅠ、XhoⅠ不宜用于鉴别松材线虫与拟松材线虫。     

松材线虫实时PCR检测技术

根据松材线虫核糖体DNA内部转录区设计了一对特异引物F11/R11与探针TaqMan-11,构成松材线虫实时PCR检测方法.采用该检测方法对分离自枯死松树体内的松材线虫、拟松材线虫、大核滑刃线虫、霍夫曼尼伞滑刃线虫和长尾属线虫进行检测.结果显示,所有松材线虫株系都能够检测到荧光信号,而拟松材线虫、大核滑刃线虫、霍夫曼尼伞滑刃线虫、长尾属线虫以及对照均没有检测到荧光信号.表明探针TaqMan-11与引物组合对松材线虫具有很强的特异性.此外,利用检测方法,在10μL的反应体系中,最少可以检测到0.005 Pg的松材线虫DNA含量.实时PCR也可以成功地检测出单条松材线虫.     

松材线虫与拟松材线虫种间杂交特性研究

选取来自中国、日本和美国的松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus)4个虫株,以及中国的拟松材线虫(B.mucronatus)2个虫株进行生物学杂交和交配对象选择试验。结果表明:松材线虫和拟松材线虫的部分虫株可以发生种间杂交,正交总交配成功率为4.2%,反交总交配成功率为10%,反交成功率是正交的2倍。杂交整体发生率极低,杂交后代较难形成可持续的繁殖种群。采用松材线虫(简称Bx)/拟松材线虫(简称Bm)快速分子检测系统对杂交F1代幼虫进行分子鉴定,结果表明F1代幼虫既含有Bx分子标记也含有Bm分子标记。继代培养30 d后,杂交后代在基因型上表现出了不同趋向的分化,其中BxAN5♀×Bm JNL1 ♂、BxAN5 ♂×BmAN5♀和BxUSA ♂×Bm JNL1♀的杂交后代趋向于成为松材线虫占主导的种群,BxJNL5 ♂×BmJNL1♀的杂交后代趋向于成为拟松材线虫占主导的种群。在有种内交配资源存在情况下,无论松材线虫还是拟松材线虫均倾向于优先选择种内交配资源。研究表明松材线虫和拟松材线虫之间存在一定的生殖隔离,自然状态下种间交配可能会产生,但杂交后代较难形成可持续性繁殖的生殖后代。     

松材线虫携带细菌的致病性

用松材线虫携带的3种细菌（菌株Njh,菌株Njt和菌株Njw)和2种线虫（松材线虫和拟松材线虫）为接种体，以黑松愈伤组织和黑松无菌苗为接种对象，分别用无菌线虫单独接种，细菌单独接种，细菌和无菌松材线虫混合接种，细菌和无菌的拟松材线虫混合接种等，测定对黑松愈伤组织和黑松无菌苗的致病能力，接种试验结果表明，单独用无菌松材线虫或松松材线虫接种，均不能使黑松愈伤组织褐变和无菌黑松苗枯萎，而用无菌线虫与上述3种细菌分别混合接种均能使黑松无菌苗发生枯萎及愈伤组织严重褐变，其中线虫和菌株Njh，线虫和菌株Njt致萎活性很强，线虫和菌株Njw致萎活性较弱，在自然界致病力弱的拟松材线虫与细菌混合接种同样能引起松苗严重萎蔫及愈伤组织褐变，实验室条件下，人工接种幼苗病害的发生与松材线虫携带的细菌密切相关，而与线虫的在关系不大，松材线虫所携带的细菌在这一病害过程中起至关重要的作用。     

松材线虫和拟松材线虫食道腺及分泌颗粒超微结构的比较研究

目前松材线虫的致病机理尚不明确,其食道腺可能在致病过程中起重要作用。文章介绍了松材线虫的寄生方式及其致病机理,并对松材线虫与拟松材线虫食道腺及分泌颗粒超微结构的比较研究进行了文献的整理和分析。     

松材线虫和拟松材线虫的繁殖力及其超氧自由基差异

采用不同毒力的松材线虫和拟松材线虫进行研究,探讨不同毒力线虫的繁殖力及虫体自身超氧自由基(O·2)释放能力差异与各虫株致病力之间的关系。对强、弱毒松材线虫和无毒拟松材线虫在单异活体培养下的繁殖力进行测定,发现三者的繁殖力从大到小依次为：无毒拟松材线虫、强毒松材线虫、弱毒松材线虫。单异活体培养下的松材线虫和拟松材线虫虫体、水培滤液的超氧自由基测定表明,两组分中的超氧自由基含量与供试线虫的毒力呈负相关,从高到低依次为：无毒拟松材线虫、弱毒松材线虫、强毒松材线虫。结果表明：供试的不同毒力松材线虫和拟松材线虫的致病力与其繁殖力无显著相关性,但与其虫体超氧自由基含量有密切关系。     

松材线虫和拟松材线虫活体染色比较其分泌-排泄物

松树萎蔫病是由松材线虫(Bursaphelenchusxylophilus)引起的松属树种上的一种毁灭性的病害,因此,对松材线虫致病机理的研究具有重要的理论和实践意义.根据松材线虫和拟松材线虫致病性的差异,通过活体染色对松材线虫和拟松材线虫分泌-排泄物进行了比较研究,发现松材线虫和拟松材线虫线虫分泌-排泄物存在明显的差别,这种差别可能与松材线虫的致病性有关.     

松材线虫和拟松材线虫种间及种内遗传相关性的RAPD分析

运用RAPD技术对来自日本、韩国、美国、加拿大和中国大陆6省及台湾地区的松材线虫和拟松材线虫16个虫株的基因组DNA进行随机扩增,聚类分析结果显示,松材线虫和拟松材线虫明显分为两大类。在松材线虫群体中,又可分为3个亚组:中国大陆虫株与日本虫株为一亚组,加拿大虫株为一亚组,中国台湾虫株与美国虫株为一亚组。拟松材线虫群体亦可分为两亚组:一为日本、中国台湾和中国江苏虫株,二为韩国和中国湖南虫株。     

3种松材线虫分子检测技术的比较分析

分别用特异性引物法、ITS-PCR-RFLP法和实时荧光PCR法对松材线虫进行了检测,通过检测时间、检测精度和操作情况等方面的比较得出:特异性引物PCR法操作简便、成本低,是目前的常规检测技术;ITS-PCR-PFLP法可以鉴定到小种,相比特异性引物法更具说服力,但耗时较多,适用于线虫种群分化研究和种类鉴定,而不适合作为一种快速检测技术;实时荧光PCR法耗时短,灵敏度高,操作简便安全,只是仪器设备要求较高,适合松材线虫的口岸检验检疫工作.     

松材线虫与其携带细菌之间的相互影响

笔者研究了从松材线虫体上分离的2 株强致病菌和1 株弱致病菌与松材线虫的相互影响。结果表明:强致病菌荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens) GcM5 1A菌株、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)ZpB1 2A菌株能够明显地促进无菌松材线虫的产卵量增加、繁殖速度加快和成虫虫体生长;同时,松材线虫也能促进强致病菌荧光假单胞菌GcM5 1A菌株、恶臭假单胞菌ZpB1 2A菌株的繁殖。而泛菌(Pantoea sp.)ZM2C菌株完全抑制了无菌松材线虫的繁殖,无菌松材线虫对泛菌ZM2C菌株的繁殖亦具有显著抑制作用。由此说明松材线虫与其携带的某些致病菌之间存在互惠共生现象,松材线虫携带的致病菌并不是偶然的污染,它们之间的互惠共生现象是在长期共生进化中形成的。笔者还讨论了互惠共生现象在松材线虫致病过程中的作用。     

松材线虫低温冷冻保存研究

为满足大量松材线虫虫株长期保存的需要,对其低温冷冻保存技术进行了研究。试验比较了不同种类及浓度冷冻保护剂对松材线虫在低温冷冻保存时的保护效果,以及冷冻线虫繁殖力与致病力的变化。结果表明:使用15%甘油和4%DMSO作为冷冻保护剂,经-80℃保存1 d后,松材线虫存活率分别为(39.4±6.6)%和(37.5±21.8)%,且冻存10 d、1个月后均没有显著性下降。与未冷冻的线虫相比,冷冻线虫的繁殖力与致病力均未发生改变。     

湖北恩施松材线虫病的防治现状及对策

湖北恩施市自1999年城区及周围发现松材线虫病以来，累计发病面积已达600多hm^2。从2000年春起，经过2年除治，取得较好的结果，但也存在一定的问题。本文对恩施松材线虫病的分布情况。防治现状及存在问题进行了阐述和分析，并提出了下一步应采取的对策。     

不同真菌对松材线虫繁殖及致病力的影响

利用3年生黑松为接种材料,研究在9种不同真菌上取食的松材线虫的繁殖和致病力变化。结果表明,真菌对松材线虫的繁殖和致病力有显著影响。松材线虫在9种真菌上取食后,松材线虫繁殖力和致病力从大到小而依存的真菌依次为灰葡萄孢(Botrytis cinerea)、拟盘多毛孢(Pestalotiopsis sp.)、盘多毛孢(Pestalotia sp.) 、拟茎点霉(Phomopsis sp.)、茎点霉(Phoma sp.)、头孢菌(Cephalosporium sp.)、交链孢(Alternaria sp.) 、炭疽菌(Colletotrichum sp.)、长喙壳(Ceratocystis sp.)。实验表明松材线虫的繁殖力与其致病力变化相一致。     

基于高通量测序技术的松材线虫研究进展

松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus)是松树萎蔫病的病原,严重威胁欧亚等国的松林资源和生态安全。自2011年松材线虫基因组首次公布以来,高通量测序技术成为该病害的重要研究手段之一。笔者从松材线虫的功能基因、非编码RNA、转录表达差异和基因组学等方面综述其致病机理,认为随着高通量测序技术的快速发展,在转录组相关研究方面,可尝试开展空间转录组、单细胞测序等新技术,在染色体基因组的支持下寻找松材线虫中具有潜在调控功能的长链非编码RNA、融合基因和环状RNA等罕见核酸分子,挖掘可能存在的甲基化、RNA编辑、结构变异等未知现象;在基因组学研究方面,可以开展基因家族扩增、大样本全基因组关联分析和数量性状定位等研究,以挖掘与松材线虫致病力和繁殖力等重要性状紧密关联的基因或位点,阐明松材线虫不同种群在进化过程中发生的适应性变化。     

松材线虫纤维素酶的活性鉴定和病理分析

分别选取了不同来源的三株松材线虫,对其可能的致病因子纤维素酶进行了基因克隆,其大小分别为1159、1138和1159 bp.随后的同源性分析结果表明这三个基因与已报道纤维素酶基因BX-eng-3具有较高的同源性,仅于含有较多重复序列处存在重复次数的差异,同时,由此获得的亲缘关系的结果与RAPD分析结果一致.对四种纤维素酶进行表达及活性确认表明四种纤维素酶水解纤维素能力相当,即纤维素酶所具有的致病性与酶活力自身无关,而是与其表达量相关,暗示存在差异的基因序列可能是纤维素酶的连接域,不影响酶的活性.选取其中一种纤维素酶BXC10进行松树纤维素水解实验,分别进行扫描电镜观察、还原糖分析和小角X射线衍射分析,结果均表明纤维素酶能有效水解松树纤维素,是重要的松材线虫病的致病因子,进一步为酶学学说提供了理论基础.     

松材线虫体内细菌对宿主繁殖和致病力的影响

为探讨松材线虫体内细菌在松材线虫病中的作用,对无菌松材线虫、体内细菌处理的松材线虫和野生型松材线虫的繁殖量和致病力进行了测定。结果表明:在非寄生条件下,无菌松材线虫的产卵量、卵孵化率和繁殖量显著高于携带细菌的松材线虫; 松材线虫体内寄生菌嗜麦芽窄食单孢菌NSPmBx03胞外代谢产物对松材线虫产卵量具有一定抑制作用。不同处理的松材线虫接种到3年生马尾松后,其繁殖量从高到低为野生型松材线虫>体内细菌处理的松材线虫>无菌松材线虫。对马尾松发病情况观察发现:接种野生型松材线虫的马尾松发病最早,病程最短; 次之为接种体内细菌处理的松材线虫; 最后是接种无菌松材线虫的处理。这表明嗜麦芽窄食单胞菌NSPmBx03对松材线虫在寄生和非寄生条件下繁殖的影响不同,对松材线虫致病力有一定增强作用。