GNL3对脑胶质瘤干细胞的调控研究

肿瘤干细胞是一小群特异的肿瘤细胞,被认为是肿瘤发生,耐药和复发的主要原因。GNL3(Guanine nucleotide-binding protein-like 3) 是MMR1/HSR1 GTP结合蛋白家族成员,在干细胞增殖中发挥重要作用。本实验室通过质谱筛选,发现GNL3蛋白在脑胶质瘤干细胞(Glioma stem cell,GSC)中特异性高表达。目前关于GNL3在脑胶质瘤干细胞中的功能及其作用机制未见文献报道。为了研究GNL3在GSC中的功能,我们利用慢病毒感染细胞体系,在GSC中应用3个不同的靶序列对GNL3基因的表达进行稳定干涉;利用Western Blot对GNL3的干涉效果进行检测。实验结果表明,在稳定敲低GNL3表达的GSC中,胶质瘤干细胞的细胞活力和肿瘤细胞球(Tumor sphere)的形成能力明显受到抑制,表明GNL3蛋白对GSC的增殖能力及自我更新能力具有重要调控,提示GNL3在胶质母细胞瘤的肿瘤发生过程中发挥一定作用。     

HMOX1在低氧条件下对胶质瘤干细胞的作用

HMOX1(Heme Oxygenase 1)属于血红素加氧酶家族,作为血红素分解代谢中的必须酶,在恶性胶质瘤中高表达。脑胶质瘤干细胞(Glioma Stem Cell,GSC)是胶质瘤中的一小群肿瘤细胞,具有无限增殖、自我更新、多向分化的能力,被认为是肿瘤发生、复发、转移的根源。本实验通过质谱筛选,发现HMOX1特异性在胶质瘤干细胞中被低氧诱导高表达。目前关于HMOX1蛋白与缺氧环境下GSC的功能相关性未见文献报道。为了研究HMOX1是否在低氧时对GSC有调控作用,我们用慢病毒感染体系在GSC中敲低HMOX1表达,接着对细胞进行1%O_2低氧培养,用Western Blot检测基因干涉效果,用Tumor Sphere形成实验观察GSC细胞表型。实验结果表明,在低氧条件下干涉GSC中HMOX1基因的表达对GSC的生长及存活有明显的抑制。综上所述,HMOX1在GSC中特异性被低氧诱导高表达,且对GSC的生长存活具有调控作用,提示HMOX1有可能是GSC在低氧微环境中的重要调控因子。     

RasGRP3维持脑胶质瘤对替莫唑胺敏感性的研究

口服替莫唑胺(TMZ)是用于治疗神经胶质瘤的一线化学疗法.然而,在治疗过程中许多胶质瘤表现出对替莫唑胺的抗性,进而导致治疗失败,疾病进展,最终导致死亡.在这项研究中,基因RasGRP3使胶质瘤细胞表现出对替莫唑胺的敏感性.首先,通过对野生型对照组胶质瘤细胞系(DMSO-U251)和替莫唑胺处理后存活的胶质瘤细胞系(TMZ-U251)进行RNA-seq数据的差异表达分析,结合脑胶质瘤信号通路分析,发现鸟嘌呤核苷酸交换因子RasGRP3表达水平显著改变.使用CRISPR/Cas9敲除RasGPR3的功能结构域,可以增加脑胶质瘤对替莫唑胺的敏感性以及降低脑胶质瘤的增殖能力.研究结果表明,RasGRP3通过促进脑胶质瘤的增殖从而对替莫唑胺表现抗性.     

Cx43蛋白在人胶质瘤中表达及与肿瘤恶性程度相关性研究

为探讨缝隙连接蛋白43(Connexin43,Cx43)在人脑胶质瘤中的表达水平及其与肿瘤恶性程度的相关性。采用HE染色、免疫组化法确定胶质瘤性质等级。标本分5组:正常脑组织组、WHOI级胶质瘤组、WHOII级胶质瘤组、WHOIII级胶质瘤组、WHOIV级胶质瘤组。通过Ki-67的染色反应肿瘤细胞增殖情况。采用Western Blot技术检测Cx43蛋白的表达。Cx43蛋白在正常脑组织中和在WHOI级胶质瘤中表达均较高,但二者差异无统计学意义(P0.05),在WHOI-IV级胶质瘤组中表达差异性有统计学意义,呈现逐渐减少的趋势。Cx43蛋白表达随着胶质瘤恶性程度的增高而降低,与细胞增殖和肿瘤组织病理学分级呈负相关。由此可知,Cx43蛋白与肿瘤细胞活性和胶质瘤恶性进展密切相关。     

小分子药物ACT001抑制人脑胶质母细胞瘤U118MG细胞系迁移作用机制的研究

脑胶质母细胞瘤(Glioblastoma,GBM)是脑肿瘤中最具致命性的高等级脑胶质瘤,目前尚无有效治愈药物.ACT001属于倍半萜内酯化合物,目前已进入Ⅰ期临床试验阶段,对脑胶质母细胞瘤有着很好的疗效,然而作用机制并不明确.本研究探究了ACT001作用脑胶质母细胞瘤的机制,发现ACT001可显著降低人脑胶质母细胞瘤U118MG的迁移能力,并下调STAT3通路相关蛋白的表达,且沉默STAT3蛋白后,U118MG迁移能力以及相关迁移蛋白的表达水平也同样受到影响.结果表明,ACT001可通过下调STAT3蛋白进而影响其下游Twist1和ZEB1迁移相关蛋白的表达水平,最终对U118MG细胞的迁移产生抑制作用.     

14-3-3及Bcl-2蛋白在人脑胶质瘤中的表达及意义

目的通过检测14-3-3和Bcl-2蛋白在人脑胶质瘤中的表达情况,探讨其在胶质瘤发生、发展中的作用机制.方法采用免疫组化S-P法对5例正常脑组织标本和68例人脑胶质瘤标本进行14-3-3和Bcl-2蛋白检测.结果与正常脑组织比较,14-3-3蛋白在胶质瘤表达异常增强(P0.05);在不同病理分级中胶质瘤组织表达无统计学意义(P0.05),随着胶质瘤恶性程度的增加,14-3-3蛋白表达的强度和范围增加(P0.05).Bcl-2蛋白在不同级别的恶性胶质瘤中阳性表达率有差别(P0.05),且表达强度随着胶质瘤病理分级增高呈明显增高趋势.结论 14-3-3和Bcl-2蛋白对胶质瘤的恶性程度、肿瘤的病理分级有影响,可作为指导临床病理诊断及分级的参考指标.     

人脑胶质瘤中MMP-9的表达及意义

目的：探讨MMP-9在人脑胶质瘤中的表达及意义。方法：采用免疫组化S-P法检测45例人脑胶质瘤及32例瘤旁正常脑组织中MMP-9蛋白的表达。结果：MMP-9在正常脑组织、低度恶性及高度恶性脑胶质瘤组织中的阳性表达率分别为15.6%,45.8%,81.0%。结论：MMP-9蛋白表达与胶质瘤的发生和恶性进展有关。     

CHD5在胚胎干细胞向神经前体细胞分化过程中的功能研究

CHD5蛋白是一种ATP依赖性染色质重塑解旋酶,属于CHD家族.CHD家族成员在胚胎发育及肿瘤发生发展过程中具有重要的作用.前期研究发现CHD5在多种不同类型的肿瘤中发挥抑癌功能,但不清楚CHD5是否影响早期胚胎干细胞分化.本研究发现随着胚胎干细胞向神经前体细胞的分化,CHD5的表达显著上调.干扰CHD5的表达之后对细胞进行向神经前体细胞分化的诱导,发现POU5F1和NANOG等胚胎干细胞标志基因表达上调,Wnt信号通路激活,而PAX6和SOX1等神经前体细胞的标志基因表达得以抑制,表明CHD5在胚胎干细胞向神经前体细胞分化过程中具有重要功能.     

mTOR抑制剂联合替莫唑胺治疗恶性胶质瘤

目的:研究mTOR抑制剂替西罗莫司(Temsirolimus)联合替莫唑胺(Temozolomide)对C6鼠胶质瘤增殖及侵袭的影响.方法:传代培养C6大鼠胶质瘤细胞,HE染色观察细胞形态的变化,MTT比色法检测药物对C6细胞的体外增殖抑制作用.原位注射法建立C6大鼠胶质瘤模型,10 d后分为替西罗莫司组、替莫唑胺组、联合药物组(替西罗莫司+替莫唑胺)及空白组,隔天给药7次,4周后断头法处死大鼠取脑,做肿瘤病理组织切片,计算肿瘤体积;TUNEL法检测肿瘤细胞凋亡指数,检测与肿瘤侵袭性有关的MMP1(基质金属蛋白酶1)的表达.结果:联合药物组促进肿瘤细胞凋亡效果显著高于替莫唑胺组(P0.01).与空白组比较,替莫唑胺组移植瘤体积下降了33.5%(P0.05),移植瘤中MMPl表达为(++),移植瘤细胞凋亡率64.6%(P0.05);联合药物组移植瘤体积下降了55.2%(P0.05),移植瘤中MMPl表达阳性(+),细胞凋亡率84.0%(P0.05).结论:西罗莫司联合替莫唑胺用药能明显抑制C6大鼠胶质瘤细胞移植瘤生长,并降低与肿瘤侵袭能力有关的MMP1蛋白表达.     

p53突变蛋白下调调控人肺腺癌细胞中E-cadherin的表达并促进细胞迁移

摘要：p53 是最重要的抑癌基因之一。在肿瘤发生发展过程中,超过50% 的人类肿瘤组织和细胞中存在 p53 基因发生突变,而且大多数为点突变,其中包括 R273H,由此产生的点突变蛋白会失去 p53 的DNA结合和特异的转录活性。最近的研究表明p53突变蛋白还可能获得一些野生型p53蛋白不具有的新的生物学活性。在本研究中,我们在人肺肿瘤细胞 H1299 中稳定表达含R273H 点突变的p53 蛋白（p53-R273H）,观察到细胞中 E-cadherin mRNA 和蛋白水平下调,同时细胞迁移能力增强。免疫荧光方法检测发现 p53-R273H 显著降低 E-cadherin 在肿瘤细胞间的表达。这些结果表明p53-R273H 突变蛋白具有下调 E-cadherin 基因的表达和促使肿瘤细胞迁移的新功能。     

长链非编码RNA CASC15在胶质瘤细胞自噬过程中的调控作用

目的 探讨长链非编码RNA CASC15在胶质瘤细胞自噬过程中的调控作用.方法 应用TCGA和GTEx数据库分析CASC15在胶质瘤组织与正常组织中的表达情况,构建过表达细胞系;应用PCR法检测CASC15在不同细胞系中的表达及转染后的表达情况,CCK8检测CASC15对细胞的生长能力的影响,Western blot检测自噬相关蛋白LC3和P62的表达.结果 CASC15在胶质瘤组织及胶质瘤细胞系中高表达,并可促进U251和U87胶质瘤细胞的生长;CASC15能够增加胶质瘤细胞LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比率,并降低P62的表达;CASC15还能促进ATG3的表达,但ATG5和ATG7无变化.结论 CASC15可促进胶质瘤细胞生长,并激活胶质瘤细胞自噬.     

秦皮乙素对荷瘤小鼠红细胞免疫功能的影响

研究秦皮乙素对S_(180)荷瘤小鼠红细胞免疫功能的影响,探讨秦皮乙素红细胞免疫抗肿瘤机制.采用体内移植S_(180)肿瘤细胞株复制S_(180)荷瘤小鼠模型.以红细胞免疫花环实验检测红细胞免疫黏附肿瘤细胞的能力;采用分光光度法测定荷瘤小鼠红细胞膜唾液酸含量、Na~+,K~+-ATP酶和Ca~(2+),Mg~(2+)-ATP酶活性.采用Western blot测定带3蛋白含量.结果表明:秦皮乙素能够增强S_(180)荷瘤小鼠红细胞免疫黏附肿瘤细胞的能力;增加红细胞膜唾液酸含量及带3蛋白含量;提高红细胞膜Na~+,K~+-ATP酶和Ca~(2+),Mg~(2+)-ATP酶活性.秦皮乙素可能通过改善S_(180)荷瘤小鼠红细胞膜的功能状态,提高膜的稳定性,增强红细胞免疫黏附肿瘤细胞的能力,从而发挥其抗肿瘤作用.     

小鼠胚胎脑特异表达的新基因bsg3的克隆及初步研究

通过消减差异筛选的方法克隆到一个在小鼠胚胎脑特异表达的基因bsg3(brain specific gene 3).它编码的蛋白与人的KIAA0961具有80.3%的同源性.bsg3基因包含一个1644bp的完整阅读框,编码一个含548个氨基酸,具有1个KRAB结构域(kruppel-associated box)和13个C2H2型锌指结构域的蛋白.该基因定位在小鼠第7号染色体上,包含5个外显子,4个内含子.以bsg3基因全长编码区为探针的原位杂交结果显示,bsg3在小鼠胚胎脑及鸡胚脑特异表达.半定量反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)的结果表明,在成体小鼠的组织中,bsg3基因脑中表达也较强.这提示bsg3基因可能在小鼠脑发育中起着重要的作用.对bsg3基因时间和空间的表达模式的分析将有助于进一步揭示它在脑发育及功能维持中的作用.     

RRP15过表达对核糖体生物发生和细胞增殖的影响

为了明确核糖体RNA加工蛋白15(RRP15)在肿瘤发生发展中的作用,通过构建稳定过表达RRP15的HeLa细胞株HeLa-Flag RRP15及其对照细胞株HeLa-Flag,利用细胞免疫荧光、蛋白免疫印迹等方法研究了RRP15过表达对核仁结构的影响,利用蔗糖密度梯度离心法提取核糖体大小亚基前体,探究了RRP15过表达对核糖体生物发生的影响,利用MTT实验和蛋白免疫印迹检测了RRP15过表达对细胞生长增殖的影响.结果发现,RRP15过表达使细胞核仁数量增多,核仁蛋白表达量上调,核糖体大小亚基前体生物发生水平均有提高,细胞生长增殖速率加快,细胞周期相关蛋白的表达增加.由此认为,RRP15可能通过增加核仁数量和提高核糖体生物发生水平增强细胞的增殖能力,进而促进肿瘤的发生与发展.     

慢病毒介导的外源基因在人牙髓干细胞中的表达

牙髓干细胞（dental pulp stem cells,hDPSC）是牙源性的间充质干细胞,具有多向分化潜能.已有的研究表明,一些蛋白因子能够诱导牙髓干细胞的牙向分化,但尚无通过过量表达某些关键基因来诱导牙髓干细胞牙向分化的报道.利用绿色荧光蛋白作为报告基因,探究慢病毒介导的外源基因在牙髓干细胞中的表达,分离并鉴定人的恒牙牙髓干细胞,用携带绿色荧光蛋白标记的慢病毒原液感染DPSC,感染病毒后的DPSC进行传代以验证外源基因的稳定表达,并将感染慢病毒后的DPSC与羟基磷灰石/磷酸三钙（hydroxyapatite/tricalcium phosphate,HA/TCP）混合移植到小鼠肾囊膜下培养8周.结果表明：用绿色荧光蛋白标记的慢病毒能够整合到牙髓干细胞的基因组中并获得稳定的表达,感染慢病毒前后的牙髓干细胞增殖率没有发生改变,感染病毒的hDPSC与HA/TCP混合移植到肾囊膜下仍能够产生牙本质牙髓样结构,因此利用慢病毒载体介导的绿色荧光蛋白并不影响牙髓干细胞的生物学特性,说明在进一步利用慢病毒载体研究过量表达基因在牙髓干细胞牙向分化的作用中,绿色荧光蛋白可以作为标记蛋白.     

Rab23在小鼠不同器官中表达的研究

为探讨Rab23蛋白在各种器官中的功能情况,研究了Rab23蛋白在小鼠不同器官组织中的表达。选用性成熟的正常成年雌、雄小鼠的各种不同器官的组织,利用免疫组织化学方法,系统地检测Rab23蛋白的表达。结果显示Rab23蛋白在小鼠的脑、卵巢、精巢、乳腺和胃组织中有明显的表达,而在心脏、肝脏、肠、肺、胸腺、肾脏和脾脏中没有表达。Rab23蛋白在小鼠脑、性腺、乳腺和胃中的特异性表达,表明该分子在这些器官组织正常功能的维持中可能具有一定的作用。实验结果还为深入研究Rab23蛋白的分子功能提供了新资料。     

肿瘤抑制因子p53蛋白在毕赤酵母中的克隆表达

TP53基因在调控细胞信号通路和抑制肿瘤细胞中发挥着重要作用.本研究利用毕赤酵母表达系统以获得大量重组p53蛋白,为此,本文将人TP53基因克隆至表达载体p PIC3.5K,电转化进入毕赤酵母GS115,通过组氨酸筛选和G418筛选,获得高拷贝稳定转化子.SDS-PAGE和Western Blot检测结果表明p53蛋白可以在毕赤酵母中表达.本研究所获酵母菌株为今后大规模生产重组p53蛋白奠定了基础.     

斑马鱼Pax3a结构域过表达对瓦登伯革氏症候群疾病影响

目的:探究斑马鱼PAX3直系同源基因Pax3a的结构域在多种组织细胞中的复杂功能.进一步了解哺乳类肌肉间质先祖细胞标志基因PAX3在胚胎发育、组织再生和肿瘤发生过程中发挥的重要作用.方法:构建斑马鱼Pax3a 4个保守结构域编码的过表达质粒,包括p-Paired box domain 3(PD3)、p-Homeobox domain (HD)、p-G protein-pathway-suppressor domain (GPD)和p-Paired box domain 7 (PD7),使用蛋白免疫印迹,细胞免疫荧光和实时荧光定量PCR方法验证体内外mRNA和蛋白水平表达,并进行体内胚胎显微注射和体外转染细胞.结果:胚胎发育变异表型的统计分析结果显示:每个结构域会引起斑马鱼胚胎产生较高比例的特异瓦登伯革综合征表型,比如白斑症、内眦外移、瞳孔变大等症状.在细胞学水平显示,每个结构域过表达对细胞迁移有不同影响.结论:Pax3a每个结构域有各自的作用通路,其功能增溢与PAX3基因突变均可产生瓦登伯革氏症候群.     

脑红蛋白与肿瘤的研究进展

脑红蛋白(neuroglobin,Ngb)是2000年发现的新型携氧球蛋白,是继血红蛋白(hemoglobin,Hgb)和肌红蛋白(myoglobin,Mgb)后发现的第三个脊椎动物球蛋白家族的成员。顾名思义,Ngb主要存在于神经组织,一般认为Ngb参与了神经细胞的氧运输、氧代谢及氧利用,但具体机制目前仍不清楚。近年来,研究发现人类多种肿瘤组织中存在Ngb表达,为揭示Ngb功能和肿瘤发生发展机制打开了新的思路。