自体细胞来源的组织工程皮肤及其实验研究

利用患者自体来源的皮肤细胞,在经过短时间的体外培养后构建组织工程皮肤,并对其移植后的转归进行动物实验观察.分离培养头皮中的角质形成细胞及创面来源的成纤维细胞,并在体外进行传代扩增.利用三维立体培养系统构建复合细胞膜片,移植于裸鼠背部全层缺损创面,以单层细胞膜片为对照,对其转归进行大体及病理学观察.体外分离培养的皮肤细胞在体外扩增2周后即可用于构建复合细胞膜片,在移植覆盖裸鼠全层皮肤创面后,伤口愈合良好,移植2月后的病理结果显示皮肤结构明显优于单层膜片移植.证明利用患者自体来源的皮肤细胞可快速构建组织工程皮肤,有望成为治疗大面积深度烧伤患者的途径之一.     

新型双层皮肤组织工程支架的构建

模拟天然皮肤的真、表皮结构,以胶原和壳聚糖为主要原料构建皮肤组织工程双层支架.将固含量0.8%(mass)的胶原-壳聚糖溶液冻干后压膜,经戊二醛交联后再冻干形成双层支架的底层,然后注入固含量0.2%(mass)的胶原-壳聚糖溶液,经冻干、交联、再冻干即得结构较稳定的双层复合海绵支架.在双层支架上培养的小鼠成纤维细胞贴壁生长正常.本研究构建的胶原-壳聚糖双层支架具有良好的结构稳定性和细胞相容性.     

壳聚糖与胶原或海藻酸复合物海绵的制备以及人胎儿皮肤成纤维细胞在其中的生长

壳聚糖与胶原或海藻酸形成高分子离子复合物后,采用浇铸/冷冻干燥技术,制备了壳聚糖复合物海绵.表征不同组成复合物海绵的亲水性和形貌,发现加入胶原或海藻酸可增加海绵的吸水性和保水性,并有助于在海绵中形成大孔结构.海绵在pH7.4的磷酸盐缓冲液中用溶菌酶进行体外降解,复合物海绵的降解速率比单纯的壳聚糖海绵稍快.在海绵中进行人胎儿皮肤成纤维细胞的培养,发现细胞在复合物海绵中的生长增殖优于单纯的壳聚糖海绵,而且复合物海绵不会像单纯胶原海绵那样在细胞培养过程中发生降解收缩.此结果有望成为较理想的组织工程支架.     

组织工程化大鼠皮肤的构建

本研究应用组织工程学技术构建了具有完整表皮和真皮结构的组织工程化大鼠皮肤。在电化学工作站中，按照吡咯单体浓度0.05mol/L、聚合时间500s、电流10mA的条件制备聚吡咯膜，采用胰蛋白酶消化法从新生SD大鼠皮肤中分离获得朊细胞并种植于聚吡咯膜上，导电培养获得较多数量的角朊细胞，将Ⅰ型胶原蛋白醋酸溶液与大鼠皮肤成纤维细胞相混合培养14d，形成胶原蛋白－成纤维细胞凝胶真皮模型，将角朊细胞于真皮模型上浸没式培养5d后，继续气－液面培养14d，经固定、切片与染色，在光镜和扫描电镜下可见所构建的真皮模型与新生大鼠真皮具有类似的结构；而大鼠皮肤模型则具有与正常新生大鼠皮肤相类似的结构，包括完整的真皮层和表皮层，表皮中含有完善的基底层、棘细胞层、颗粒层与角度层，该模型的建立，为组织工程化人皮肤的构建和临床应用奠定了基础。     

前交叉韧带组织工程种子细胞筛选的初步研究

为组织工程方法构建前交叉韧带筛选一种理想的种子细胞。用体外分离培养兔前交叉韧带（ACL）、内侧副韧带（MCL）、跟腱（AT）、皮肤成纤维细胞（SK）,比较四种细胞的生长状态、增殖活性及Ⅰ、Ⅲ型胶原分泌量。在含体积分数10％胎牛血清的DMEM培养液中,四种细胞生长良好、细胞形态相似,但以SK细胞生长最快,AT细胞次之,MCL细胞和ACL细胞生长最慢。SK、MCL、ACL细胞均分泌Ⅰ、Ⅲ型胶原,AT细胞只分泌Ⅰ型胶原。SK细胞Ⅰ型胶原染色密度较MCL、ACL、AT细胞高,SK细胞Ⅲ型胶原染色密度较MCL、ACL细胞高。说明SK细胞增殖活性高,分泌Ⅰ、Ⅲ型胶原多,取材简便,是理想的前交叉韧带组织工程种子细胞。     

新型前交叉韧带支架材料的构建及其生物相容性的实验研究

探讨以聚羟基丁酸己酯/聚左旋乳酸(PHB/PLLA1∶1)胶原杂化支架作为前交叉韧带组织工程载体材料的可行性。制备"三明治"样结构PHB/PLLA共聚物并测量其孔隙率等指标。以I型胶原对制备的PHB/PLLA支架进行杂化,获得PHB/PLLA胶原杂化支架。扫描电镜观察其表面结构。将兔皮肤成纤维细胞(SF)接种于PHB/PLLA胶原杂化支架,共培养5d后,扫描电镜下观察其在材料上生长情况。PHB/PLLA支架杂化后胶原填充于纤维空隙,分布比较均匀。体外培养的皮肤成纤维细胞成功种植在支架材料上,在材料上粘附、生长良好。说明构建的支架材料具有良好的三维构型和生物相容性,有望为前交叉韧带损伤的修复提供了一种新型的支架材料。     

DiI荧光标记示踪兔皮肤成纤维细胞修复前交叉韧带损伤的研究

体内采用组织工程方法构建前交叉韧带种子细胞筛选研究,提供了一种理想的细胞标记的方法.体外分离培养兔皮肤成纤维细胞(SF),比较皮肤成纤维细胞使用荧光染料CM-DiI体外标记前后细胞的生长状态、增殖活性以及检测SF复合纤维生物蛋白胶植入前交叉韧带上12周后的荧光表达情况.结果表明CM-Dil标记SF效果良好,标记阳性率高于95%.而标记前后SF增殖活性无明显变化,荧光标记在体内实验12周后仍有表达.从而证实CM-DiI是筛选前交叉韧带组织工程种子细胞筛选研究中细胞标记、示踪的良好标记物.     

厦大研制成功人体组织器官体外构建新技术

由厦门大学生物医学工程研究中心研发的“医用复合型组织工程支架材料”近期通过专家鉴定。这项新技术能将不同的细胞“种”到支架材料上，“种”出不同的器官，可以用来治疗皮肤烧伤、骨骼病缺损等人体组织器官的病缺损。目前，厦门大学生物医学工程研究中心已制备出了复合型组织工程化人工骨和组织化人工皮肤支架材料，在体外构建了组织工程化的组织器官，并在动物实验研究中取得了满意的结果。     

组织工程真皮替代物的构建及在创伤修复中的作用

以双层胶原-壳聚糖海绵为支架构建组织工程真皮替代物并研究其在大鼠创伤愈合中的作用.将双层胶原-壳聚糖海绵支架埋植于SD大鼠皮下以考察其组织相容性;将SD大鼠皮肤中分离的成纤维细胞种植在支架上体外构建人工真皮替代物,并将该替代物移植到SD大鼠皮肤缺损处以修复创面.皮下埋植实验显示支架植入早期有炎症反应,但一周后炎症反应逐渐减轻,而且有成纤维细胞和毛细血管的侵入.皮肤移植实验结果显示:术后第7天和第14天实验组创面表皮再生和肉芽组织增生比对照组更快更明显;第14天和第21天实验组创面面积明显小于对照组(p<0.05).因此以双层胶原-壳聚糖海绵为支架构建的组织工程真皮替代物具有良好的生物相容性,并能促进皮肤创面的愈合,可以作为人工真皮替代物用于皮肤缺损的修复.     

灌注速率对成纤维细胞在三维支架中生长和胶原合成的影响

为了降低工程化组织体外构建过程中的传质限制,采用自行研制的灌注生物反应器系统,以人皮肤成纤维细胞为模型细胞,以PET(Poly(ethylene terephthalate))为三维支架,构建工程化真皮组织,考察灌注速率对成纤维细胞生长和胞外基质合成的影响。将人皮肤成纤维细胞灌注接种于PET支架,分别以0.02、0.2、0.8 cm/min的灌注速率培养18 d。结果表明,灌注培养能促进细胞增殖,提高细胞在3D支架中均匀分布;与静态培养和0.02 cm/min的灌注速率相比,在0.2 cm/min和0.8 cm/min的灌注速率下进行培养,提高了细胞的葡萄糖比消耗速率,刺激细胞合成和分泌更多的胶原基质,但增加了流失到培养液中胶原的比例,灌注培养是体外构建工程化真皮组织的有效方法。     

一种胶原蛋白寡肽对人皮肤成纤维细胞增殖及胶原分泌的影响

研究了罗非鱼鱼鳞胶原蛋白寡肽对体外培养人皮肤成纤维细胞增殖与Ⅰ型胶原蛋白分泌的影响.采用WST-8法测定了胶原蛋白寡肽对人皮肤成纤维细胞增殖的影响,采用ELISA法检测了胶原蛋白寡肽对人皮肤成纤维细胞Ⅰ型胶原蛋白分泌的影响.实验表明,罗非鱼鱼鳞胶原蛋白寡肽能促进人皮肤成纤维细胞增殖(P＜0.01),以及人皮肤成纤维细胞...     

人心房成纤维细胞体外组织块贴壁培养与鉴定

从建立体外循环将进行心脏手术的风湿性心脏病患者体内无菌下取心脏停跳前右心耳组织，采用组织块贴壁法进行心房成纤维细胞的分离培养，通过光学显微镜观察培养后的细胞形态，并通过免疫细胞化学的方法鉴定所分离培养的细胞。贴壁4—6d后可见长梭形贴壁生长的细胞游离出组织块，细胞生长迅速，2—3d后即呈融合状态，细胞排列紧密，有的交叉重叠生长，胞体较大，细胞浆透明，细胞核较大，呈椭圆形，无自发性搏动。免疫细胞化学检测显示所培养细胞波形蛋白呈阳性反应。通过组织块贴壁法顺利分离人心房成纤维细胞。     

培养方法及胎牛血清浓度对人胎儿成纤维细胞体外生长的影响

采用单细胞培养法和组织块培养法从原代培养人胎儿成纤维细胞,并在不同体积分数胎牛血清(FBS)(0%、4%、8%、10%、12%)的条件下观察人胎儿成纤维细胞培养的状况并采用台盼蓝染色法进行活细胞计数.结果表明,早期由组织块培养法原代培养获取的细胞形态要比单细胞培养法原代培养获取的细胞稍好些,且在细胞传代后极少出现无法贴壁的死细胞.FBS对hFFs生长影响比较明显.在实际应用中,在体积分数8%FBS下,采用组织块培养法进行人胎儿成纤维细胞体外培养,效果良好.     

细胞外基质对体外培养兔关节软骨细胞增殖及基质代谢的影响

目的：观察软骨组织的主要细胞外基质成分：Ⅱ型胶原、蛋白多糖、透明质酸对体外单层培养的兔关节软骨细胞的增殖及基质合成的影响。方法：原代分离、培养兔关节软骨细胞,分别向其中添加Ⅱ型胶原、蛋白多糖和透明质酸。采用改良MTT法检测细胞的增殖情况,Aleian Blue法检测基质蛋白多糖含量及羟脯氨酸法测定软骨细胞胶原产量。结果：单独添加Ⅱ型胶原（50μg／mL）组、蛋白多糖（50μg／mL）组和透明质酸（100μg／mL）组及三者联合添加实验组与对照组相比,对关节软骨细胞的增殖及胶原、蛋白多糖的合成未见明显统计学差异（P〉0．05）。结论：正常软骨组织的主要基质成分对体外培养的兔关节软骨细胞增殖、蛋白多糖和胶原的合成无明显影响。     

不同接受液和动物皮肤对格列美脲体外经皮渗透行为的影响

建立格列美脲体外透皮吸收的HPLC分析方法,采用改良Franz双室渗透扩散装置,以累积渗透量、透皮速率常数和透皮时滞为评价指标,研究了5种透皮吸收接受液和6种实验动物皮肤对格列美脲体外经皮渗透行为的影响.结果表明:①所建立的HPLC方法在0.1～30μg@mL-1间线性良好,高中低质量浓度样品的日内和日间相对标准偏差RSD均小于3%,最低检测质量浓度5.55 ng@mL-1,最低检测限0.28 ng;②与其它接受液-生理盐水、乙醇/生理盐水、PEG400/生理盐水和pH7.4磷酸盐缓冲液相比,乙醇/PEG400/生理盐水具有最大的透皮速率常数和最短的透皮时滞;③在大鼠、小鼠、裸鼠、豚鼠、猫和新西兰大白兔等动物皮肤中,裸鼠的透皮速率常数最大,豚鼠最小;裸鼠的透皮时滞最短,小鼠最长.另外,在猫皮作为透皮实验皮肤的特性中,发现猫皮透皮速率较小,透皮时滞却较短.提示在格列美脲的体外透皮实验中,采用乙醇PEG400/生理盐水作接受液,裸鼠皮肤作实验皮肤,可获得最大的透皮速率常数和最短的透皮时滞.     

闽北山地城镇人居空间结构脉络研究

以人本中心的人居空间结构脉络为切入点,基于环境行为学的理论框架,从人、行为、环境的互动关系中研究和探索闽北独特的人居空间脉络体系,寻求闽北地域性人居空间的理性组织方式。     

花背蟾蜍角膜和皮肤蛋白质的SDS-PAGE分析

本文用梯度SDS-PAGE方法,分析和比较了花背蟾蜍蝌蚪和成体皮肤及成体角膜中蛋白质组分的异同,结果表明成体角膜约有33种蛋白质组分;成体皮肤约有27种;蝌蚪皮肤约24种.蝌蚪皮肤与成体皮肤蛋白质组分数量和分布趋势相似,但成体皮肤的组分比蝌蚪的多,一些蛋白质组分的相对含量与蝌蚪的有差别.角膜与前两者相比差别明显,一是蛋白质组分数较多,其次分布趋势差异较大.