中华按蚊GSTO1基因的鉴定及生物信息学分析

谷胱甘肽S-转移酶(GST)是有机体内一类具有解毒和抗氧化等多功能的超家族蛋白酶。在昆虫中GST主要分为七大家族,Omega家族(GSTO)为研究较少的家族。在本研究中,通过Blast方法搜索中华按蚊(Anopheles sinensis)转录组数据,得到中华按蚊GSTO1cDNA序列,全长1 059bp,其中阅读框ORF长744bp,编码248个氨基酸。推测该基因编码蛋白的分子量和等电点分别为28.5kD和6.92。分析发现该蛋白不存在跨膜区和信号肽,亚细胞定位预测显示该蛋白质位于细胞质中。同源性分析表明GSTO1蛋白与达氏按蚊(Anopheles darlingi)氨基酸序列相似性最高。本研究进一步丰富了GST蛋白的基础数据,为进一步研究昆虫GSTO蛋白的功能奠定了理论基础。     

yC16基因在Escherichia coli中的表达及表达产物的纯化

yC16(cDNA, 2.9kb)是果蝇yema基因的转录片段.为制备yC16编码蛋白作为免疫原,本实验用GST融合基因表达载体pGEX-2T在Escherichia coli中合成该基因的蛋白,并与谷胱苷肽-s-转移酶(GST)融合形成融合蛋白.结果由裂解细菌所得到的融合蛋白为水溶性,并且可以在非变性的条件下,通过亲和层析作用在固定化的谷胱苷肽上加以纯化,然后再利用具有识别特异位点的蛋白水解酶--凝血酶或凝血因子Xa的切割作用,将融合蛋白中的GST成分除掉.实验结果表明,使用pGEX载体合成克隆基因多肽,是一种有效而可靠的方法,步骤简单.     

LvCTL1与WSSV复制的相互关系研究

C型凝集素(CTL)是一类重要的先天性免疫因子,在对虾机体的免疫防御中具有重要的作用.该研究利用相对定量PCR实验检测基因表达量、绝对定量PCR实验检测病毒拷贝数、组织切片分析实验检测感染病毒细胞数.实验数据显示:WSSV感染能显著上调LvCTL1的表达;WSSV感染的LvCTL1敲降的凡纳滨对虾中,膜囊蛋白VP28表达量、病毒拷贝数和胃上皮细胞中的感染细胞数都显著高于注射dsEGFP对照组.研究结果表明:WSSV感染后,机体通过上调LvCTL1表达来抑制WSSV复制.     

植物中外源蛋白Netrin-1的瞬时表达

植物瞬时表达系统具有安全、快速、经济和高效的特点,已经成为近些年来国内外的研究热点之一.本研究利用来源于烟草花叶病毒TMV的载体30B成功构建了植物瞬时表达载体p35S-30B-Netrin-1,并在烟草中成功地表达了神经轴突细胞导向生长因子-1(Netrin-1).利用报告基因进一步对植物瞬时表达体系进行了优化研究,确定了利用烟草瞬时表达外源蛋白Netrin-1的最适条件,为将来在植物中进行外源蛋白的瞬时表达和快速生产奠定了实验基础.     

利用酵母双杂交技术筛选与CCDC58相互作用的蛋白

卷曲螺旋是存在于多种天然蛋白质中的一种结构域,涉及调节基因表达,膜融合以及细胞分裂等多种重要的生物学功能.CCDC58是一种由人体宿主细胞编码的蛋白质,含有卷曲螺旋结构域,由144个氨基酸组成,编码CCDC58的基因定位于人类3号染色体上.目前对该蛋白的研究不是很多,它的具体作用机制及相关的互作蛋白并不清楚.本实验通过酵母双杂交技术,以CCDC58作为诱饵,在cDNA文库中寻找与CCDC58相互作用的蛋白,最后通过反向验证筛选出5个可能有相互作用的蛋白.为了在体外进一步确认这种相互作用,本实验通过GST Pull-down实验,最终确认TP53BP2和CCDC58具有很强的相互作用.     

靶向HIV-1细胞受体基因CCR5的人工miRNA的构建与鉴定

趋化因子CCR5是HIV-1入侵机体细胞的主要辅助受体之一,通过抑制CCR5的表达可以在一定程度上阻断HIV-1的复制进程.miRNA介导的RNA干扰相比经典的siRNA在应用中具有更多的特点.本研究的目的是构建可特异有效靶向CCR5的人工miRNA元件.本研究以CCR5基因序列为模板设计了14个miRNA靶序列,以天然miR-30a为基础骨架通过靶序列区替换构建人工miRNA元件.通过将miRNA表达质粒与携带靶序列区的报告质粒的共转染抑制实验检测不同miRNA的抑制效率,结果显示miCCR-13A具有较好的抑制效率和特异性.进一步将miCCR-13A表达载体转染CCR5阳性的HIV-1受体细胞株TZM-b1,RT-PCR检测显示miCCR-13A可在细胞中获得有效表达,同时应用免疫流式细胞术检测显示在miCCR-13A转染细胞相比对照细胞的CCR5蛋白的检测活性明显降低.进一步的研究显示miCCR-13A在细胞中不会影响细胞活性和干扰素效应相关基因osa1和stat1 mRNA水平,具有良好的特异性.本研究获得的可特异靶向CCR5的人工miRNA元件可为进一步的抗HIV-1研究提供重要基础.     

绿色荧光蛋白GFP多克隆抗体的制备及在多种细胞中的特异性鉴定

绿色荧光蛋白是当前在生物及生物医学研究当中应用最为广泛的一种荧光标记蛋白.为开发一种高灵敏度、高特异性以及简单经济的GFP多克隆抗体,并使之适用于在跨物种细胞里表达的GFP蛋白进行检测,本文利用gfp基因cDNA全序列分别构建了带有6×His和GST标签的原核表达载体pET28A-gfp和p GEX-2T-gfp,并将其转入大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)细胞进行诱导表达,而后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)表达鉴定,分别获得了相对分子质量为2.6×10~4和5.2×10~4的重组6×His/GST-GFP融合蛋白.将亲和纯化的6×His-GFP融合蛋白免疫新西兰大白兔,采集第5次免疫后血清用ELISA测定效价为1﹕32,000.抗血清依次经Protein A亲和纯化和GST-GFP抗原抗体纯化后,用免疫印迹实验(Western blot)方法检测抗体特异性,结果表明制备的多克隆抗体能很好地识别在莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)、HEK293细胞和大肠杆菌中表达的GFP,对继续开展GFP相关研究具有重要意义.     

外源蛋白在巴氏毕赤酵母中高效表达的策略

高效表达外源蛋白, 在理论和实践上特别是在生物制药中具有重要意义, 巴氏毕赤酵母( Pichia pastoris) 是表达外源蛋白最理想的真核表达系统之一.影响外源蛋白在 P. pastoris中表达的因素很多, 主要包括外源基因自身的特性、载体、宿主细胞几个方面,了解和灵活运用它们的联系,有助于获得外源基因在 P. pastoris 中的高效表达.     

酵母双杂交筛选PMEPA1互作蛋白

采用酵母双杂交技术筛选与前列腺跨膜蛋白PMEPA1相互作用的蛋白质,构建了pGBKT7-PMEPA1诱饵质粒,获得与PMEPA1互作蛋白,GST pull-down实验确定2种蛋白间的相互作用.构建了诱饵载体转化酵母菌Y2HGold,对酵母宿主无毒性、无自激活活性.得到阳性克隆Dynactin6,GST pull-down实验证实PMEPA1与Dynactin6蛋白间相互作用.推测蛋白Dynactin6可能参与调控PMEPA1在细胞的运输.     

国家自然科学基金项目介绍

<正>具有任意伸展结构的两栖类皮肤抗菌肤chensinin-1b抗LPS引起的感染性休克与免疫调节的分子机制研究抗菌肽可以在细胞外与脂多糖(LPS)竞争性结合,阻断LPS诱导的炎疚信号传导通路,减轻过度炎症反应给机体带来的损伤.但我们的前期研完表明,具有任意伸展结构抗