卡介苗Hsp16.3基因突变株对小鼠巨噬细胞RAW 264.7自噬的影响*

构建及鉴定卡介苗(BCG)Hsp16.3基因突变株,观察该突变株对小鼠巨噬细胞自噬功能的影响。通过聚合酶链反应(PCR)的方法扩增Hsp16.3基因两侧分子量分别为663 bp和684 bp的两个DNA片段,并将这两个目的片段分别插入p KO载体上相应的位点。通过硫酸卡那霉素筛选,利用双酶切以及测序的方法,获得阳性重组质粒p KO-Hsp16.3。将阳性重组质粒p KO-Hsp16.3电转入BCG感受态细胞中,经过硫酸卡那霉素和蔗糖两次筛选,得到BCG Hsp16.3基因突变株。将筛选培养的BCG Hsp16.3突变株用于小鼠巨噬细胞的感染实验,并通过Western Blot和细胞免疫荧光技术对自噬相关蛋白的表达水平的变化进行观察及分析。成功获得重组质粒p KO-Hsp16.3的阳性克隆;电转化该重组质粒,并经过硫酸卡那霉素筛选和蔗糖反筛选,成功得到BCG Hsp16.3基因突变株。通过Western Blot以及免疫荧光分析发现,BCG Hsp16.3基因的突变株促进了小鼠巨噬细胞自噬的发生。     

Heat Treatment of Small Heat Shock Proteins α-Crystallin and Hsp16.3: Structural Changes vs. Chaperone-like Activity

Small heat shock proteins are a conserved,abundant and ubiquitious protein family[1] . Theyhave been detected in all types of organisms,including archaea,bacteria,and eukarya.In spiteof a relatively low overall homology betweendifferent members,they are grouped togetherbased on (a) containing a conservedα- crystallindomain that is preceded by a variable N- terminalregion and followed by an unconserved C- terminalsequence;(b) consisting of mainlyβ- sheets in thesecondary structure;and (c) for…     

Hsp16.3中一个高度保守疏水残基的定点突变

结核杆菌小分子热休克蛋白Ｈｓｐ１６．３为一由三个三聚体组成的寡聚蛋白,并具有分子伴娘活性（Ｃｈａｎｇｅｔａｌ．,Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．,１９９６,２７１：７２１８～７２２３）。为研究高度保守疏水片段中高度保守疏水亮氨酸残基（Ｌｅｕ１２１）对寡聚体结构和活性的影响,该残基被分别定点突变成天冬氨酸（Ａｓｐ）、天冬酰胺（Ａｓｎ）、缬氨酸（Ｖａｌ）和丙氨酸（Ａｌａ）等。结果发现当Ｌｅｕ１２１被突变成Ｖａｌ和Ａｌａ时,通过ＳＤＳ－ＰＡＧＥ凝胶电泳检测仍可见重组蛋白在大肠杆菌中的高水平表达,而当被突变成Ａｓｐ和Ａｓｎ时,在ＳＤＳ－ＰＡＧＥ胶上,见不到Ｈｓｐ１６．３蛋白带。表明该残基可能对寡聚蛋白的结构稳定起重要作用。     

麻疯树小热激蛋白JcHSP-17.5的纯化与活性鉴定

将实验室已有的pET32a-JcHSP17.5重组载体,经测序验证后,转入大肠杆菌BL21(DE3)plysS中,不同温度条件下,用不同浓度异丙基硫代-D-半乳糖苷(IPTG)诱导重组蛋白表达,优化表达条件;选择镍离子亲和层析柱(Ni-NTA)纯化JcHSP-17.5蛋白,SDS-PAGE电泳检测蛋白纯度;通过热激聚合反应来鉴定蛋白的分子伴侣活性.结果表明,17℃,200r/min,0.5mM IPTG诱导13h为JcHSP-17.5蛋白的最佳诱导表达条件,使用200mmol/L咪唑缓冲液纯化蛋白后,每500mL菌液可得到1.345mg的电泳纯蛋白,该蛋白在高温(45℃)条件下能够阻止苹果酸脱氢酶(MDH)发生聚合反应,表现出较强的分子伴侣活性.     

钙调素通过HSP70调控热激转录因子的活性

凝胶阻滞分析结果显示,70kD的热激蛋白(HSP70)抑制热激转录因子(HSF)的DNA结合活性;利用免疫共沉淀法在细胞提取液中检测到了CaMHSP70复合物的存在,并且热激后CaMHSP70复合物含量增加.表明钙调素(CaM)调控HSF活性可能是通过与HSP70结合起作用.     

肝大部切除前后热休克处理对热休克蛋白、酸性磷酸酶和碱性磷酸酶活性影响的分析

综合了磷酸酶的原位复性电泳、体视学分析、比色分析等方法分析①切除大白鼠大部分肝后的肝再生期间,②热休克处理大白鼠（４６℃、３０ｍｉｎ）恢复８ｈ,再切除大部分肝后的肝再生期间,③切除大部分肝恢复４ｈ,再热休克处理（４６℃、３０ｍｉｎ）后的肝再生期间热休克蛋白（ＨＳＣ７０／ＨＳＰ６８）、酸性磷酸酶（ＡＣＰ）和碱性磷酸酶（ＡＫＰ）动态变化的资料,从６个方面比较分析了ＨＳＣ７０／ＨＳＰ６８,ＡＣＰ和ＡＫＰ在肝再生中的相互关系及对肝再生的可能作用     

分子伴侣及其作用机理的研究概况

分子伴侣为一类与其他蛋白不稳定构象结合并使之稳定的蛋白质,广泛分布于各种生物体内。本文对分子伴侣的最新研究作一综述。     

水稻热激蛋白基因（HSP70）的PCR法快速分析

通过比较几个已知ＨＳＰ７０的ｃＤＮＡ顺序，用ＰＣＧＥＮＥ软件中的ＰＣＲＰＬＡＮ程序设计出一对简并引物，然后从水稻（广陆矮４号）总ＤＮＡ中扩增出ＨＳＰ７０的基因片段并将其克隆到ｐＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ载体中。在完成了对克隆的序列测定之后，用ＰＣＧＥＮＥ中有关程序对其进行同源分析，并对其他已知的ＨＳＰ７０作了一些分类及分子进化方面的探讨。     

营养元素调控热休克蛋白研究进展

热休克蛋白(Heat Shock Protein,HSP)是生物体在受热或其他不利环境因素刺激下应激合成的一组特殊蛋白质.HSP的生物学功能广泛,不仅表现在热应激条件下参与细胞的抗损伤、修复和热耐受过程,保护细胞生命活动,而且在蛋白质折叠、跨膜运输、细胞骨架及核骨架稳定等方面发挥重要作用.由于机体的营养状况与应激能力密切相关,本文主要综述了营养元素对HSP合成的调控作用.     

淞江鲈HSP70基因cDNA部分序列克隆及其组织表达差异

为了研究HSP70(heat shock protein 70)是否可作为淞江鲈(Trachidermus fasciatus Heckel)养殖中的应激监测分子指标,根据鲤鱼热应激蛋白70基因序列(AYl20894)设计并合成引物,以淞江鲈肝脏组织总RNA为模板,获得淞江鲈HSP70基因cDNA部分序列,长度为480bp,GenBank登陆号为KC342053.序列分析结果显示此序列与红笛鲷(Lutjanus sanguineus)等有较高的同源性.同时,应用所获淞江鲈HSP70基因部分序列,以淞江鲈β-actin基因的序列(HM449124)为内参,利用荧光定量PCR技术,检测淞江鲈肌肉、肠、脑、皮肤、性腺、肝脏、心脏、鳃、鳍9个组织的表达差异.结果表明,HSP70在淞江鲈9个组织中普遍表达,其中在鳍中表达量最高,在性腺、鳃、脑、肌肉、肝脏、皮肤、肠中的表达量依次递减,在心脏中表达量最低.在鳍中HSP70的表达量可能成为衡量淞江鲈应激程度的指标.     

Expression profile analysis of 9 heat shock protein genes throughout the life cycle and under abiotic stress in rice

Plant heat shock proteins (Hsps) facilitate protein folding or assembly under diverse developmental and adverse environmental conditions. Nine OsHsps were identified in our previous study from a proteomic analysis of rice cv. IRAT 109 leaf samples at the seedling stage under drought stress. To obtain additional information on the 9 OsHsp genes, this study focused on an expression profile analysis at different development stages throughout the life cycle of rice, and under different abiotic stresses and phyto-hormone treatments. The 9 genes exhibited distinctive expression patterns in different organs or development stages. Five of the genes (OsHsp72.90, OsHsp72.57, OsHsp71.18, OsHsp24.15 and OsHsp18.03) showed high expression in the endosperm, indicating that OsHsp genes may play important roles in rice seed development. All 9 OsHsps were up-regulated under heat, polyethylene glycol, and abscisic acid treatment, whereas salt stress caused up-regulation of 6 genes (OsHsp93.04, OsHsp71.10, OsHsp71.18, OsHsp72.57, OsHsp24.15 and OsHsp18.03) and cold stress resulted in down-regulation of OsHsp93.04 and OsHsp72.57. These diverse expression profiles imply potential functional diversity of the Hsp gene family in rice.     

低分子量热激蛋白在种子中的表达特征

选用了包括顽拗性和正常性种子在内的４种种子为实验材料，运用ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔ方法，检测了低分子量热激蛋白，发现被检的４种种子都含有低分子量热激蛋白．认为低分子量热激蛋白在种子中表达的起因是组织特异性，而不是脱水胁迫所至     

氯胺酮相关性膀胱炎大鼠逼尿肌热休克蛋白27的表达及其意义

研究热休克蛋白27(HSP27)在氯胺酮诱导膀胱炎大鼠逼尿肌中的表达及临床意义.基于氯胺酮腹腔内注射诱导大鼠膀胱炎模型,选择不同时间通过尿流动力学检测膀胱收缩功能,收集大鼠膀胱组织,常规病理染色观察膀胱粘膜及逼尿肌结构,免疫组化法检测HSP27在逼尿肌中的表达水平.实验后观察结果表明,同对照组相比,实验组尿动力学表现为膀胱收缩频率显著增加及初感膀胱容量明显减小;对照组膀胱组织无明显病理及免疫表达变化,而实验组可观察到不同程度膀胱粘膜充血,炎症细胞浸润,HSP27表达水平的上升,且HSP27表达水平与诱导时间呈正相关.实验结果表明HSP27的表达水平可能与氯胺酮膀胱炎的逼尿肌收缩活动程度相关.     

微波对K562/MDR细胞凋亡及热休克蛋白70表达的影响

研究微波引起白血病耐药细胞株K562／MDR的凋亡以及对热休克蛋白70表达的影响。使用MTT方法检测细胞存活率,AnnexinV/PI双参数法检测K562／MDR细胞的凋亡率,流式细胞仪检测热休克蛋白70的表达。结果表明,微波可起K562／MDR细胞的凋亡,经0.20,0.60W/cm^2功率密度微波作用20min（保持43℃）,37℃培养24h后,细胞凋亡率分别为10％、13．6％,而水浴加热引起的凋亡率仅为3．8％,微波照射影响细胞内热休克蛋白70的表达,在43℃时,0.20,0.60W/cm^2功率密度微波作用20min抑制HSP70的表达,实验说明微波能引起K562／MDR细胞的凋亡,该凋亡与微波引起的热休克蛋白表达的改变可能有联系。     

拟南芥Hsp40蛋白AtDjA5在大肠杆菌中的功能分析

通过分析大肠杆菌dnaJ缺失菌株在43℃下的生长表型, 发现AtDjA5及其J Domain能够功能性地替换DnaJ及其J Domain. 免疫共沉淀实验结果表明AtDjA5与DnaK存在相互作用. 由Western blot检测推测AtDjA5能够稳定大肠杆菌热激转录因子σ32并下调热激蛋白DnaK表达量. 这些发现说明AtDjA5在大肠杆菌中具有与DnaJ相似的功能.     

热休克蛋白及其在生殖中的作用

本文简述了热休克蛋白的发现分类和调节以及其在生殖中的作用。     

日本血吸虫童虫在东方田鼠和昆明小鼠中的蛋白差异初探

东方田鼠具有天然抗日本血吸虫活性,为了筛选抗日本血吸虫疫苗分子,通过日本血吸虫尾蚴感染东方田鼠和昆明小鼠,感染11天后收集东方田鼠和昆明小鼠肝童虫．肝童虫经组织匀浆收集蛋白质并进行蛋白质定量后SDS-PAGE分离,切取差异蛋白条带进行蛋白质鉴定．发现差异蛋白主要为日本血吸虫结构蛋白,能量代谢相关蛋白以及热休克蛋白等．为进一步研究抗日本血吸虫疫苗奠定了基础．