CRISPR/Cas9基因组编辑新进展

正2016年4月份,美国农业部(USDA)在一封公开函中声明,他们不会对利用CRISPR/Cas9技术得到的基因编辑蘑菇进行监管。这意味着这种蘑菇可以不通过相关机构的监管程序就可以栽培并销售。这是第一种得到美国政府绿灯通行的利用CRISPR/Cas9技术得到的有机体,也是过去5年中不受USDA监管的30种基因改造有机体之一。这30种有机体大多数是植物,其中几种是通过ZFN和TALEN基因编辑技术得到的,而使用CRISPR/Cas9技术得到的作物终于也得到了同样的通行政策。该项目的参与者、中国科学院遗传与发育生物学研究所研究员高彩霞说:我有信心看到将有更多的基因编辑作物不受管理部门的监管。     

基因组编辑技术——CRISPR/Cas系统

基因定点编辑技术包括基于胚胎干细胞及同源基因片段重组的基因打靶技术、锌指结构(ZFN)、类转录激活因子效应物(TALEN)以及CRISPR/Cas系统,CRISPR/Cas系统具有操作简单、突变率高、成本低,同时可针对多个基因等优点;该技术可进行定点修饰,如敲除、插入、替换等.目前CRISPR/Cas系统已成功应用到小鼠、人类细胞、线虫、果蝇、斑马鱼、拟南芥、水稻和猴等.文章将对基因修饰技术发展脉络做统一梳理,并将系统阐述CRISPR/Cas系统的原理、应用以及该技术的优缺点.     

利用CRISPR/Cas9技术编辑水稻植酸合成酶IPK1基因

低植酸是作物育种目标之一,然而植酸对植物自身的影响至今未有科学评估.为此,在建立粳型常规水稻"金粳818"再生体系基础上,利用农杆菌介导的遗传转化方法将针对植酸合成最后一步磷酸化反应的1, 3,4, 5, 6-五磷酸肌醇2-激酶基因IPK1构建的3个CRISPR/Cas9载体分别转入"金粳818".分子检测发现,再生的42株植株中,40株为转化株,显示转化率高达95%.靶点序列分析发现,26株绿色转化株中,1株基因组发生了编辑.编辑株靶点测序发现,除碱基缺失外,附近序列错配达30%.这些结果为水稻低植酸种质的创制及植酸的功能分析奠定了技术基础.同时,本文对水稻再生株的白化现象进行了探讨.     

CRISPR/Cas基因编辑系统的研究进展及应用

规律成簇间隔短回文重复序列(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)和CRISPR相关蛋白(CRISPR-associated proteins,Cas)组成的CRISPR/Cas系统是古细菌和细菌特有的抵御外源核酸入侵的适应性免疫机制.其中CRISPR/Cas9系统已经在动植物基因功能研究和模型构建等方面得到广泛的应用.另外,CRISPR/Cas系统在基因治疗和核酸分子检测领域的应用也是近年来研究的热点.本文主要对CRISPR/Cas系统的发现、组成和作用机制以及该系统的应用进行综述.     

利用CRISPR/Cas9技术制备Mindin基因敲除小鼠

针对Mindin基因编码序列设计3条单链向导RNA(sgRNA),制备相应质粒,将表达sgRNA和Cas9蛋白的质粒共同电转入小鼠成纤维细胞L929中,通过药物筛选获得细胞库.经单克隆测序检测细胞库中基因组的突变效率,选择效率最佳的sgRNA.体外转录获取sgRNA和Cas9mRNA,进行小鼠受精卵的显微注射后提取小鼠基因组DNA测序鉴定.产生的40只小鼠中17只发生不同程度的碱基插入或缺失,其中23号小鼠缺失10个碱基造成移码突变,Mindin基因表达被破坏,成功构建出Mindin基因敲除小鼠,为深入研究Mindin基因的生物学功能奠定了基础.     

利用CRISPR/Cas9技术靶向敲除番茄SlMYBL基因

MYB类蛋白家族是所有真核生物中存在的庞大且功能丰富的一类转录因子,MYB蛋白主要参与形态建成、次生代谢等进而参与植物的非生物胁迫.文章通过比对美国国家生物技术信息中心(National Cen-ter for Biotechnology Information,NCBI)数据库,在番茄中发现了一个具有EAR转录抑制子的R1-MYB类转录因子,即SlMYBL,通过同源克隆获得SLMYBL基因的全长cDNA.SlMYBL基因在番茄的所有组织中均有表达,在果实中的表达量相对较高,其次是根和叶片.有研究表明R1-MYB类转录因子可参与植株的逆境应答,为了解SlMYBL是否响应逆境应答,文章定量分析了番茄在不同胁迫处理下SlMYBL基因的转录水平,发现其转录水平在盐胁迫下明显降低,而对甘露醇胁迫并没有明显的差异,表明SlMYBL基因可能参与了番茄植株响应盐胁迫的过程.为研究SlMYBL基因作用的分子机理,进一步构建了该基因的CRISPR表达载体,并获得SlMYBL基因的CRISPR敲除转基因番茄.该研究为发现SlMYBL基因在植物生长发育中的作用奠定了一定的理论基础.     

水稻OsDTH10基因CRISPR/Cas9编辑突变体的创建及功能分析

为了探究OsDTH10基因在水稻生长发育及开花中的作用,利用CRISPR/Cas9基因编辑技术对OsDTH10基因进行定向编辑.在OsDTH10基因的第4个外显子处设计sgRNA的靶位点,通过PCR扩增与Os U6SK空载体连接形成OsU6SK-sg RNA融合载体,再将获得的sg RNA和Cas9连接到植物双元载体pCAMBI1300中,得到重组载体pCAMBI1300-CRISPR/Cas9-OsDTH10.利用农杆菌介导的植物转化法得到转基因植株,对其进行鉴定并测序.本研究共获得3个株系8株转基因植株,测序结果显示,2号株系的4株转基因植株由于发生了单碱基的插入,基因测序出现了套峰.田间表型观察发现,2号株系的4株T0代转基因植株抽穗期早于空载体对照,获得的T1代转基因植株抽穗期比对照的提早8 d.这些结果表明,重组载体pCAMBI1300-CRISPR/Cas9-OsDTH10成功实现了对水稻OsDTH10基因的定向编辑.     

基于CRISPR/Cas9基因编辑技术构建PD-L1-GFP报告基因HT29细胞株

利用CRISPR/Cas9基因编辑技术和同源重组技术在PD-L1基因的特定位置敲入绿色荧光蛋白(GFP)序列,构建含有PD-L1-GFP报告基因的结肠癌细胞(HT29)稳定细胞株。根据CRISPR-Cas9靶点设计原则,针对PD-L1基因终止密码子设计两对sgRNA,退火形成双链后连接至Lenti-V2空载质粒中,转化培养后提取质粒并测序验证。对于正确的Lenti-V2-sgRNA重组质粒,T7E1酶切验证其基因编辑效率。根据靶点位置设计左同源臂+GFP+右同源臂序列合成Donor片段,双酶切后连接至pUC19,重组载体转化扩增后同样进行质粒提取和测序验证。将验证成功的Lenti-V2-sgRNA和pUC19-donor-GFP共转染HT29细胞,荧光显微镜检测GFP表达情况,菌落PCR及基因测序验证GFP报告基因的靶向插入效果。经酶切和测序鉴定,靶向编辑PD-L1的Cas9载体Lenti-V2-gRNA和含GFP基因的Donor质粒pUC19-donor-GFP构建成功。两个重组质粒转染HT29细胞后,显微观察、多克隆验证、单克隆筛选及鉴定结果显示,GFP成功转入HT29细胞并进行了...     

RNA靶向基因组编辑技术CRISPR/Cas9在昆虫中的研究进展

介绍CRISPR/Cas9系统的基本结构、作用机制、脱靶效应以及在昆虫基因编辑和基因功能研究中的应用,并对该技术可能出现的问题及应用前景进行展望,为进一步将该技术应用于非模式昆虫的基因编辑和基因功能研究提供参考.     

CRISPR/Cas9基因转录激活技术的建立及其应用

建立基于CRISPR/Cas9的基因转录激活技术,实现在HEK293细胞中激活cGAS基因的转录。首先利用慢病毒载体构建稳定表达Cas9的HEK293细胞;并采用Real-time PCR和western blot方法鉴定Cas9蛋白质表达效果。再选取不同靶序列,分别构建用于激活cGAS基因转录的sgRNA载体,将构建好的序列载体与CRISPR体系工具质粒共转染至稳定表达Cas9的HEK293细胞中。采用Real-time PCR方法检测细胞中内源cGAS的转录激活效果。成功建立了基于CRISPR/Cas9的基因转录激活技术,并在c GAS基因阴性表达的细胞中激活基因的转录。