VMP1基因的克隆及其抗体的制备与鉴定

为了得到效价高、特异性强、能用于检测内源性 VMP1 蛋白的抗体,采用RT-PCR 法,从L929细胞株中克隆鼠VMP1基因,重组入pCMV5载体,用 PCR 扩增与其氨基酸 132-239 区域对应的DNA片断,将该片段连接到原核表达载体 pGST parallel 中,在大肠杆菌 BL21 菌株中大量表达,经谷胱甘肽-琼脂糖树脂纯化后,得到高纯度的 VMP1抗原.免疫新西兰兔,获得抗 VMP1 蛋白的兔抗血清,将血清纯化后即得到抗 VMP1 的多克隆抗体.用 Western blot 分析手段检测了该抗体的特异性及效价.在用该抗体检测外源性和内源性 VMP1 蛋白的试验中,证实该抗体效价高,特异性强,效果很理想.此方法可用于获得大量廉价的抗 VMP1 蛋白的高滴度和高特异性的抗体,为进一步研究 VMP1 在细胞内,尤其是在信号转导通路中的功能和作用奠定了基础.     

VMP1基因的克隆及其抗体的制备与鉴定

为了得到效价高、特异性强、能用于检测内源性VMP1蛋白的抗体，采用RT-PCR法，从L929细胞株中克隆鼠VMP1基因，重组入pCMVS载体，用PCR扩增与其氨基酸132-239区域对应的DNA片断，将该片段连接到原核表达载体pGST parallel中，在大肠杆菌BL21菌株中大量表达，经谷胱甘肽-琼脂糖树脂纯化后，得到高纯度的VMP1抗原．免疫新西兰兔，获得抗VMP1蛋白的兔抗血清，将血清纯化后即得到抗VMP1的多克隆抗体．用Western blot分析手段检测了该抗体的特异性及效价．在用该抗体检测外源性和内源性VMP1蛋白的试验中，证实该抗体效价高，特异性强，效果很理想．此方法可用于获得大量廉价的抗VMP1蛋白的高滴度和高特异性的抗体，为进一步研究VMP1在细胞内，尤其是在信号转导通路中的功能和作用奠定了基础．     

左氧氟沙星人工抗原的制备及其抗体鉴定

用N-羟基琥珀酰亚胺法把左氧氟沙星与载体蛋白牛血清白蛋白偶联制备免疫抗原,用氯甲酸异丁酯法将左氧氟沙星与鸡卵清蛋白偶联,制备包被检测抗原,采用紫外扫描法对合成的抗原进行鉴定.用免疫抗原免疫大白兔获得抗左氧氟沙星多克隆抗体血清,经间接ELISA试验检测特异性抗体效价,测得效价达1:212以上.通过紫外扫描及间接ELISA试验,结果表明,制备的抗原和抗体获得成功.     

兔抗人多发性骨髓瘤细胞多克隆抗体的制备与鉴定

制备人多发性骨髓瘤全细胞兔多克隆抗体。用人多发性骨髓瘤细胞系ARH-77全细胞和福氏完全佐剂通过背部皮内多点注射首次免疫新西兰大白兔,第14 d用ARH-77全细胞和福氏不完全佐剂同样剂量加强免疫,第28 d和38 d时再次免疫。第45 d颈动脉采血80 mL,4℃静置过夜,收集血清。然后采用亲和层析系统纯化血清中的多克隆抗体。用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测纯化多克隆抗体的效价;免疫印迹法和荧光免疫细胞化学检测纯化多克隆抗体的特异性。结果:ELISA检测多克隆抗体滴度为1∶20 000,免疫印迹检测结果显示该抗体具有较高特异性,荧光免疫细胞化学检测多克隆抗体能够有效的结合细胞表面抗原。实验获得了高效价的特异性的兔抗人骨髓瘤细胞多克隆抗体,为进一步研究多发性骨髓瘤诊断和治疗奠定了基础。     

兔抗Myosin Ⅹ多克隆抗体的制备及初步应用

为制备兔抗肌球蛋白Ⅹ(myosinⅩ,MyoⅩ)多克隆抗体,合成了含有MyoⅩN端1 000～1 021个氨基酸的多肽,将纯化后的多肽与钥孔戚血蓝蛋白(keyhole limpethemocyanin,KLH)进行交联;通过背部皮下免疫新西兰大白兔获得免疫血清,并通过ELISA、免疫印迹、免疫荧光等分析对免疫血清进行了初步的验证.结果表明:经过4次免疫后可获得免疫血清,ELISA检测表明抗体终效价达到1∶51 200,抗原吸附实验进一步证明了此多克隆抗体的特异性.利用获得的多克隆抗体检测了多种组织中MyoⅩ的表达,发现兔抗MyoⅩ多克隆抗体可特异性识别多种组织中的MyoⅩ.免疫荧光染色表明该抗体可以显示MyoⅩ在COS-7细胞、NLT细胞和神经元中的分布.     

GGPPS多克隆抗体的制备与鉴定

构建人香叶基香叶基二磷酸合成酶基因(GGPPS)原核表达载体,制备兔抗人GGPPS多克隆抗体.利用DNA重组技术构建原核表达载体pGEX-4T-GGPPS,诱导表达GGPPS融合蛋白,分离纯化该融合蛋白后,作为免疫原免疫家兔制备多克隆抗体.成功构建了pGEX-4T-1-GGPPS原核表达载体,转化Rosetta菌株后可高效表达GGPPS融合蛋白,成功制备GGPPS多克隆抗体,间接ELISA法测定抗体效价为1∶32000,并且抗体具有良好特异性.成功克隆GGPPS基因并制备了特异性的兔抗人GGPPS多克隆抗体,为进一步研究GGPPS的功能奠定了基础.     

三聚氰胺多克隆抗体的制备及鉴定

用三聚氰胺偶联蛋白为抗原,按不同的时间规律及抗原剂量对成年兔进行免疫,获得特异性的三聚氰胺多克隆抗体.效价检验应用蛋白质电泳和间接ELISA方法.应用10%及12.5% SDS-PAGE,验证血清中IgG抗体的产生情况,再用间接酶联免疫吸附试验测得第4次免疫后抗体效价达到1.2×107.此法易于实施,且获得的血清样品具有较高的效价,为今后三聚氰胺多克隆抗体的分离纯化提供了可靠的实验依据.     

E-cadherin前体蛋白抗体的制备与鉴定

E-cadherin是一种重要的肿瘤转移抑制因子,它的功能异常能够导致肿瘤细胞的转移.细胞内成熟的E-cadherin由其前体蛋白剪切而成,目前还没有针对该前体蛋白的特异性抗体.为了得到能用于检测内源性E-cadherin前体蛋白(E-cadherin pre)的抗体,对E-cadherin基因用限制性内切酶PstⅠ和PvuⅡ进行双酶切,获取E-cadherin基因的N-端片段,将其重组入原核表达载体pGEX-4T-2中,在大肠杆菌BL21(DE3)菌株中表达重组蛋白,经谷胱甘肽-琼脂糖珠子纯化后,得到较高纯度的E-cadherin前体抗原.用该抗原免疫新西兰兔,获得抗血清,进一步纯化血清得到抗E-cadherinpre的多克隆抗体.用Western blot检测了外源性和内源性E-cadherin pre,发现该抗体效价高且特异性强;免疫荧光实验表明该抗体可以用于细胞染色,为深入研究E-cadherin pre在细胞内的功能奠定了基础.     

小鼠肥大细胞蛋白酶4的原核表达和多克隆抗体制备

文章构建小鼠肥大细胞蛋白酶4（mMCP-4）原核表达体系,获得原核表达蛋白,并制备兔抗mMCP-4多克隆抗体,提取小鼠脾细胞总 RNA ,运用 RT-PCR技术获得目的基因 mMCP-4,构建重组原核表达载体pET28a-mMCP-4,将其转化到大肠杆菌BL21中诱导表达。mMCP-4融合蛋白经Ni亲和层析法纯化后,作为抗原免疫兔子获得mMCP-4多克隆抗体。采用ELISA法测抗体效价,western blot检测抗体特异性。结果表明,构建重组表达质粒pET28a-mMCP-4,经大规模原核表达获得大量mMCP-4融合蛋白,制备的兔抗血清效价达1∶128000,并表现出较好特异性。研究结果为进一步研究mMCP-4生物学功能奠定了基础。     

胸腺淋巴细胞免疫血清制备的初步研究

试验研究以猪胸腺淋巴细胞为完全抗原,采用一定的免疫程序致敏兔,刺激兔产生抗猪胸腺淋巴细胞的特异性抗体,在30天后分离血清,免疫效价达到1：640,证明兔血清含有该特异抗体,免疫程序合理,抗体效价确实．     

DSCR1抗体制备与应用

本实验利用Fmoc固相多肽合成的方法合成DSCRI氨基端一个多肽片段(55-70AA),经HPLC纯化后偶联到匙孔槭血蓝蛋白,免疫新西兰雄兔后采血检测、纯化、经Westem blotting、免疫沉淀证实得到的抗体为抗DSCR1的特异抗体。谊抗体即能检测人源DSCR1蛋白,又能检测小鼠的DSCR1蛋白。运用获得的DSCR1多克隆抗体进行功能研究。发现DSCR1广泛存在泛素化,参与泛素化-蛋白酶体途径。     

整合素连接激酶相关磷酸酶（ILKAP）抗体的制备及其特异性分析

以整合素连接激酶相关磷酸酶（ILKAP）全蛋白为抗原, 采用腿部肌肉注射和耳缘静脉注射相结合的方法对新西兰大白兔进行免疫, 共免疫6次, 最
终获得ILKAP抗血清. 采用Protein A agrose柱纯化抗体, 获得ILKAP的多克隆抗体. 免疫印迹分析表明, 所获得的ILKAP多克隆抗体具有较高的特异性, 间接ELISA方法测定ILKAP多克隆抗体的滴度为1 ∶1 600. 免疫荧光分析表明, 所获得的ILKAP多克隆抗体在细胞水平应用效果较好.     

BIG-3的原核表达、纯化及其多克隆抗体的制备与鉴定

原核表达、纯化骨形态发生蛋白诱导基因（BIG-3,BMP-2-induced gene 3kb）所编码的融合蛋白并制备其多克隆抗体。将BIG-3基因插入原核表达载体PGEX-4T-2的多克隆位点获得pGEX-4T-2-BIG-3重组表达载体,转化大肠杆菌BL21（DE3）菌株,诱导表达,SDS-PAGE鉴定融合蛋白表达情况及Sepharose4B层析柱亲和层析法纯化的融合蛋白;用纯化的融合蛋白免疫新西兰大白兔制备其多克隆抗体,并以Western blot鉴定其特异性。结果在大肠杆菌中获得BIG-3-GST融合蛋白高水平的诱导表达,经Sepharose4B层析柱亲和层析,GST-BIG-3融合蛋白在电泳图片上显示较为清晰的单一条带,所制备的多克隆抗体具有较高的特异性。说明在大肠杆菌中成功表达且以亲和层析法纯化得到了BIG-3-GST融合蛋白,并制备了特异性较高的多克隆抗体。     

Effects of temperature on the expression of STN7 andphosphorylation of LHCII proteins in Arabidopsis thaliana

In Arabidopsis thaliana, STN7 kinase is required for phosphorylation of LHCII and for state transitions. In this paper, a hydrophilic polypeptide, derived from the amino acid sequence of STN7, was conjugated to a carrier protein, bovine serum albumin (BSA), to obtain the polyclonal antibody. Immunogenicity and specificity of the polyclonal antibody were evaluated by agar gel immunodiffusion (AGID) test and Western blot analysis. The results show that besides the phosphorylation of LHCII proteins, also the expression of STN7 was regulated by temperature conditions. In addition, the change tendency of LHCII proteins phosphorylation was not only coherent with expression of STN7 with respect to increasing temperature, but also closely related to state transitions. These results would provide useful information for studying regulatory mechanism of LHCII proteins phosphorylation and expression of STN7.     

轮状病毒间接免疫荧光的检测方法

以兔抗SA11多克隆抗体为一抗、 Alexa 488标记的山羊抗兔抗体为二抗, 通过对反应条件的优化建立轮状病毒（RV）检测的间接免疫荧光法（IFA）. 实验结果表明, IFA最佳工作条件为: MA104细胞密度为每孔2×10⁴个, 胰酶活化轮状病毒质量浓度为1 μg/mL, 培养时间为18 h, 一抗最适稀释度为1∶800, 二抗最适稀释度为1∶500.     

盘基网柄菌allC的克隆、表达和多克隆抗体的制备

运用RT-PCR技术从盘基网柄菌(Dictyostelium discoideum)总mRNA中克隆到了尿囊酸酶基因(allC),该基因编码区开放读框长1 100bp,编码的蛋白约42kD.由于是在野生型和突变型细胞中差异表达的片段,表明该基因在盘基网柄菌多细胞发育中起到重要作用,因此将allC克隆入融合表达载体pET-32a(+),在大肠杆菌E.coliBL21(DE3)中进行诱导表达带有6个组氨酸标签的尿囊酸酶(ALC)融合蛋白,经镍柱亲和层析,获得了电泳纯蛋白.用纯化的融合蛋白免疫新西兰大白兔,制备多克隆抗体.ELISA测得制备的抗ALC蛋白的多克隆抗体的效价可达1∶64 000,Western Blotting检测证明该抗体有较强的针对ALC蛋白的专一性.这些数据表明重组质粒表达的ALC融合蛋白具有良好的抗原性,制备ALC的多克隆抗体有良好特异性和效价,能够满足针对ALC免疫印迹和细胞内定位检测等实验要求,为深入研究ALC蛋白在盘基网柄菌多细胞发育的功能作用提供了有力工具.     

吗啡人工抗原的合成及多克隆抗体的制备

利用化学法合成吗啡人工抗原,将此抗原免疫新西兰大白兔制备抗吗啡多克隆抗体.利用混合酸酐法将吗啡人工抗原分别与蛋白质载体BSA及OVA偶联,经蛋白质电泳以及紫外扫描检测,证明吗啡人工抗原合成成功.用间酶联免疫检测法检测,证明制备得到了高效价的吗啡多克隆抗体血清,且与吗啡人工抗原具有高特异性反应,可用于吗啡免疫学检测方法的研究.     

黏着斑蛋白Supervillin的抗体制备及纯化

黏着斑蛋白Supervillin（SVIL）是一个细胞膜结合蛋白分子,定位于细胞与细胞外基质接触面的黏着斑。为了进一步研究 SVIL蛋白分子在细胞内的功能,应用分子克隆技术构建原核细胞表达质粒 ｐＧＥＸＫＧ ＳＶＩＬＣ３０２和ｐＨＩＳ８ ＳＶＩＬＣ３０２,并在细菌 ＢＬ ２１（ＤＥ３）中用 ＩＰＴＧ分别诱导表达 ＧＳＴ ＳＶＩＬＣ３０２和 ＨＩＳ ＳＶＩＬＣ３０２融合蛋白。用谷胱甘肽琼脂糖凝胶柱亲和层析纯化 ＧＳＴ ＳＶＩＬＣ３０２蛋白,然后免疫新西兰大白兔制备 ＳＶＩＬ多克隆抗体,并用 Ｎｉ ＮＴＡ柱子结合 ＨＩＳ ＳＶＩＬＣ３０２蛋白,对其进行交联,纯化抗体。ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔ（ＷＢ）和 Ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ（ＩＦ）实验证明该抗体可以识别外源的 ＧＦＰ ＳＶＩＬ和内源的 ＳＶＩＬ蛋白,并且可以用于蛋白免疫沉淀实验。表明此ＳＶＩＬ多克隆抗体具有较高的特异性和灵敏度,为进一步研究黏着斑蛋白 ＳＶＩＬ在细胞内的功能奠定了坚实的基础。