谷胱甘肽亲和层析介质的制备条件及其层析特性研究

以琼脂糖凝胶4FF(Sepharose 4 Fast Flow)为基质,1,4-丁二醇二缩水甘油醚(BDGE)为活化剂,通过活化、偶联谷胱甘肽(GSH),得到GSH亲和层析介质.实验结果表明:活化及偶联的优化条件为10,m L基质加入0.42,g Na OH、15,m L二甲基亚砜(DMSO)、15,m L BDGE,反应温度为40,℃,反应时间为6,h;偶联溶液p H 6.5,反应温度为37,℃,反应时间为24,h.在此条件下,环氧基修饰密度可达60~65,μmol/m L;所制备的介质载量为(14.19±0.98)mg/m L.以此介质对谷胱甘肽S–转移酶(GST)、融合蛋白GST-Bcl-2、GST-Ald、GST-PTPN12进行纯化,结果表明,该介质纯化效果较好、载量高、稳定性能较好,可重复使用.     

免疫亲和层析法从兔杂交瘤培养上清液中纯化兔抗烟草花叶病毒的单克隆抗体

报道一种较为简易的免疫亲和层析技术,从兔杂交瘤培养上清中分离纯化单克隆抗体。先用过碘酸钠活化层析柱填料Sepharose4B,然后加入碱性碳酸钠缓冲液与羊抗兔IgG于4℃偶联过夜,冲洗后加硼氢化钠使偶联稳定,经1％BSA-PBS溶液封闭,冲洗后即得到免疫亲和层析柱。将兔抗烟草花叶病毒（TMV）杂交瘤细胞2E2和3C6的培养上清加入亲和柱中,37℃下吸附1h,冲洗后用pH3稀盐酸溶液洗脱,洗脱液用Tris溶液调至pH中性,供SDS-PAGE分析和Westernblot实验。洗脱液中存在分子量约为60000与52000的二条蛋白条带。Westernblot结果显示,纯化抗体对纯化TMV样品,以及TMV侵染的烟草病叶中的TMV都具有非常好的识别能力。利用所报道的免疫亲和层析技术,从兔杂交瘤培养上清中成功分离纯化到兔抗TMV的单克隆抗体。     

大豆凝集素的分离纯化及活性鉴定

以D-半乳糖胺为配基、 FF-sepharose 4B为固定相, 制备大豆凝集素亲和层析填料. 分离和纯化大豆中的大豆凝集素蛋白, 测定其纯度、 免疫原性和凝集活性, 并与美国Sigma公司的标准品比较. 结果表明： 每毫升GalN-FF-Sepharose-4B层析填料能结合10 mg大豆凝集素; 纯化获得的大豆凝集素分子量为30 000; SDS-PAGE测定纯度大于98%; Western blot结果为阳性; 1 mg/mL SBA血集效价为1/2^10; 其纯度、 免疫原性和凝集活性等指标与大豆凝集素标准品相同, 与理论值相符.     

酵母培养液中胰蛋白酶初探

利用鸡卵黏蛋白对于胰蛋白酶有天然抑制性的特点,从鸡蛋清中分离纯化了鸡卵黏蛋白,将其偶联至Sepharose 4B制作成亲和层析介质,用于从不同种类酵母,处于不同时间段的培养液中,分离纯化得到了具有胰蛋白酶活性的物质。由此初步证明了酵母培养液中确有可能存在胰蛋白酶。因此,利用酵母工程菌生产蛋白质的时候,若加入一定量的胰蛋白酶抑制剂,有可能提高目的蛋白的产率。     

重组人脑利钠肽制备中内毒素的去除工艺

在重组人脑利钠肽(BNP)的分离纯化过程中去除内毒素,选用Chelating Sepharose FF亲和柱层析、Q Sepharose FF阴离子交换柱层析、Source 15反相柱层析、SP Sepharose FF阳离子交换柱层析组合的方法对BNP进行分离纯化。按照2015版药典中鲎试剂法检测各层析柱纯化阶段得到蛋白溶液中的内毒素含量;用HPLC方法检测各阶段所得蛋白的浓度和纯度。BNP制备过程中每一步层析在内毒素去除方面都有良好的效果,内毒素去除率超过90%;最终纯化所得BNP原液内毒素含量降至0.34 EU/0.5 mg,去除率高于99.99%,蛋白纯度高于98%。所设计的四步层析纯化分离方法在纯化重组人脑利钠肽的同时也能高效的去除蛋白溶液中内毒素,所得原液内毒素的含量远远低于国家药典对注射剂内毒素含量的最低限制,为重组人脑利钠肽的工业化生产奠定了基础。     

重组人脑利钠肽制备中内毒素去除工艺研究

[目的]在重组人脑利钠肽(BNP)的分离纯化过程中去除内毒素。[方法]选用Chelating Sepharose FF亲和柱层析、Q Sepharose FF阴离子交换柱层析、Source 15反相柱层析、SP Sepharose FF阳离子交换柱层析组合的方法对BNP进行分离纯化;按照2010版药典中鲎试剂法检测各层析柱纯化阶段得到蛋白溶液中的内毒素含量;并用HPLC方法检测各阶段所得蛋白的浓度和纯度。[结果]BNP制备过程中每一步层析在内毒素去除方面都有良好的效果,内毒素去除率超过90%;最终纯化所得BNP原液内毒素含量降至0.34EU/0.5mg,去除率高于99.99%,蛋白纯度高于98%;[结论]所设计的四步层析纯化分离方法在纯化重组人脑利钠肽的同时也能高效的去除蛋白溶液中内毒素,所得原液内毒素的含量远远低于国家药典对注射剂内毒素含量的最低限制,为重组脑利钠肽的工业化生产奠定了基础。     

番薯过氧化物酶的分离纯化及其性质研究

从番薯皮中分离和纯化番薯过氧化物酶,对其酶学性质进行表征,分析了温度、pH对酶促反应的影响,考查了酶的热稳定性、酸碱稳定性.分离纯化过程包括匀浆、水提、双水相萃取、Sepharose CL-6B凝胶层析、Phenyl Sepharose 6 fast flow疏水层析、Con A Sepharose 4B亲和层析.经纯...     

BIG-3的原核表达、纯化及其多克隆抗体的制备与鉴定

原核表达、纯化骨形态发生蛋白诱导基因（BIG-3,BMP-2-induced gene 3kb）所编码的融合蛋白并制备其多克隆抗体。将BIG-3基因插入原核表达载体PGEX-4T-2的多克隆位点获得pGEX-4T-2-BIG-3重组表达载体,转化大肠杆菌BL21（DE3）菌株,诱导表达,SDS-PAGE鉴定融合蛋白表达情况及Sepharose4B层析柱亲和层析法纯化的融合蛋白;用纯化的融合蛋白免疫新西兰大白兔制备其多克隆抗体,并以Western blot鉴定其特异性。结果在大肠杆菌中获得BIG-3-GST融合蛋白高水平的诱导表达,经Sepharose4B层析柱亲和层析,GST-BIG-3融合蛋白在电泳图片上显示较为清晰的单一条带,所制备的多克隆抗体具有较高的特异性。说明在大肠杆菌中成功表达且以亲和层析法纯化得到了BIG-3-GST融合蛋白,并制备了特异性较高的多克隆抗体。     

番薯过氧化物酶的分离纯化及其性质研究

从番薯皮中分离和纯化番薯过氧化物酶,对其酶学性质进行表征,分析了温度、pH对酶促反应的影响,考查了酶的热稳定性、酸碱稳定性.分离纯化过程包括匀浆、水提、双水相萃取、Sepharose CL-6B凝胶层析、Phenyl Sepharose 6 fast flow疏水层析、Con A Sepharose 4B亲和层析.经纯化的番薯过氧化物酶比活力为6 930 U/mg,SDS-PAGE显示一条带,分子量为34 000,RZ值为2.酶反应的最适pH在5.5附近,最适温度为70℃;在中性偏碱性条件下酶的稳定性非常高,60℃保温1 h,酶活力残余60%.结果表明番薯过氧化物酶是一种良好的耐酸碱、耐热过氧化物酶.     

不同锰砂滤料对地下水除锰的去除能力分析

目的掌握不同锰砂滤料对地下水中锰离子的去除速率和去除机理,为选择理想的锰砂滤料提供科学依据.方法选择水厂滤池成熟滤料和4种不同品质的锰砂分别装在5组滤柱中对同一原水进行处理,测定滤柱出水锰离子质量浓度,分析其成熟期、并与反应速率方程进行拟合,综合分析锰砂的去除能力.结果 B柱马山高品质天然锰砂成熟期为28 d、C柱马山低品质天然锰砂和E柱葫芦岛杨家杖天然锰砂滤料成熟期为66 d、D柱河南巩义天然锰砂成熟期为86 d.在锰砂滤料形成活性滤膜后,不同锰砂都表现出了一级反应速率方程的特征,B柱马山高品质锰砂的成熟期最短,去除速率高,是除锰理想的锰砂滤料.结论锰砂品质对生成活性滤膜和成熟期影响很大,锰砂生成活性滤膜后的质量浓度随时间变化曲线符合一级反应速率方程.     

饲用植物多序岩黄芪酸性多糖测定及提取工艺技术研究

主要采用水提醇沉法提取红芪多糖,将该粗多糖中酸性多糖进行含量测定,以及用DEAE - Sepharose Fast Flow阴离子交换柱和732阴离子交换层析柱进行红芪酸性多糖的分离工艺研究,将不同层析方法得到的酸性多糖再经Sepharose 6B Fast Flow凝胶层析纯度分析.实验结果表明,DEAE- Sepharose Fast Flow阴离子交换柱和732阴离子交换层析柱可用于红芪酸性多糖的分离.     

测定血小板衍生生长因子活性方法的改进

以BALB／C小鼠胚胎成纤维细胞(BALB／C3T3)作为靶细胞，经20mmol／L醋酸钠平衡后的CM—Sepharose(CMS)吸附过的胎牛血清作为基础培养血清，应用[3-(4，5-dimethylthi—azolyl)-2，5-diphenyhetrazolium bromide，MTT]方法测定血小板源生长因子(platelet—derived growth factor，PDGF)诱导细胞增殖的生物活性，结果表明，该方法具有良好的量效关系，且精确度、重现性均较高。     

浒苔多糖EPⅢ的分离与鉴定

利用乙醇分级对冻融后的浒苔热水提取物中的多糖进行了分级,得到了三个级分.采用凝胶层析法对其中一个级分进行纯化后得EPⅢ,经Sepharose CL-6B,DEAE-Sepharose CL-6B检测均为单一对称洗脱峰,紫外检测未见有蛋白吸收峰 .采用Sepharose CL-6B柱层析法测得其相对分子质量为38 000.经气相色谱分析该组分的单糖组成为鼠李糖、木糖、甘露糖、半乳糖、葡萄糖,其摩尔比为12.70∶1.00∶0.64∶0.32∶19.03.     

重组人碱性成纤维细胞生长因子诱导Balb/c3T3细胞增殖的实验研究

目的研究不同浓度重组人碱性成纤维细胞因子对Balb/c 3T3细胞增殖活性的影响.方法重组质粒pGEX-bFGF转入到DH5α大肠杆菌体内,增菌培养表达bFGF,亲和层析纯化,制备8种不同药物浓度的bFGF,分别进行诱导Balb/c 3T3细胞增殖实验研究,MTT法检测各组细胞增殖活性.结果 bFGF诱导Balb/c 3T3细胞增殖存在浓度依赖性,最适浓度为4～16μg/L.结论 bFGF具有较好的诱导Balb/c 3T3细胞增殖的能力,为后续研究工作奠定实验基础.     

质粒pcDNA3.1-IL-24的制备和纯化

探索基因治疗用质粒pcDNA3.1-IL-24的规模化制备和纯化工艺。碱性裂解提取质粒后,以异丙醇和LiCl沉淀法去除大分子RNA。然后,使用DEAE Sepharose FF离子交换层析去除染色体DNA、小分子RNA、蛋白质等杂质。经本工艺纯化的质粒pcDNA3.1-IL-24浓度为727μg/mL,纯度为1.87,蛋白质含量为0.007μg/mL质粒DNA,未检测到RNA、抗生素残留。此工艺避免使用动物源性酶类及有毒试剂,有效去除质粒DNA制备过程中产生的杂质,可实现药剂水平质粒DNA的规模制备。     

灰树花胞外多糖的分离纯化及免疫调节作用

通过对灰树花(Grifola frondosa)深层发酵的胞外多糖(EXGFP)进行分离纯化,研究其性质和免疫活性.灰树花胞外粗多糖经醇沉、酶–sevag脱蛋白和Sephadex G-100色谱柱分离得到纯化组分EXGFP-A.通过Sepharose 4B凝胶柱法和HPLC法鉴定EXGFP-A的纯度,结果表明EXGFP-A是均一多糖组分,纯度为92.68%,.理化性质实验结果表明,EXGFP-A是一种非淀粉类、不含糖醛酸及多酚类物质,含有α–D–葡萄糖苷键和吡喃糖环的中性多糖.MTT实验表明,当EXGFP-A质量浓度为80,μg/m L、作用48,h时,小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞增殖指数达到最大值,为137.5%,.吞噬活性实验结果证实EXGFP-A能够提高RAW264.7细胞对中性红的吞噬能力,扫描电子显微镜结果发现RAW264.7细胞经过EXGFP-A处理后,细胞表现出了明显的活化特征.     

昆虫细胞杆状病毒表达人生长激素的纯化及性质研究

在昆虫细胞杆状病毒中表达的人生长激素，经CM－52离子交换柱层析和Phenyl-Sepharose CL-4B疏水柱层析后，去除了93％杂蛋白。再用CNBr-activated Sepharose 4B亲和柱层析的方法，获得高纯度的生长激素样品。SDS－PAGE结果表明，纯化样品在SDS－PAGE图谱呈现一条带，分子量为22kD。Western杂交结果表明，纯化样品与生长激素标准品有相似的免疫活性。胰肽图谱分析结果显示纯化样品和标准品具有相同的一级结构。DNS－CL测N末端表明，纯化样品的N末端为苯丙氨酸，所有这些性质均与天然人生长激素相同。     

重组金针菇免疫调节蛋白的纯化及生物活性研究

目的研究重组的金针菇免疫调节蛋白(re FIP-fve)对小鼠脾淋巴细胞的增殖作用、诱导小鼠脾淋巴细胞对白细胞介素-2(IL-2)的促分泌作用及对血细胞的凝集作用.方法采用离子交换色谱法,利用SP Sepharose XL色谱柱纯化重组的免疫调节蛋白;将纯化后的蛋白作用于小鼠脾淋巴细胞和血细胞,用MTT法检测蛋白对脾细胞增殖和血细胞凝集的影响;用ELISA法检测蛋白对淋巴细胞分泌细胞因子的作用.结果经过SP Sepharose XL色谱柱纯化后可获得纯度为86%的重组蛋白;纯化蛋白浓度在80μg/m L时最大限度促进细胞增殖;蛋白浓度在2μg/m L时开始出现凝血;ELISA检测结果显示:重组的金针菇免疫调节蛋白能明显增强小鼠脾淋巴细胞分泌白细胞介素2(IL-2)的水平.结论经过SP Sepharose XL色谱柱纯化后可获得纯度较高的蛋白;纯化后的蛋白与小鼠脾淋巴细胞共同培养,不仅可以促进脾细胞的增殖,而且能增强小鼠脾淋巴细胞分泌白细胞介素2的水平;蛋白与血细胞共同培养能够促进血细胞的凝集.     

葡萄球菌GST-mTSST-1融合蛋白的纯化及其免疫活性鉴定

将DH5α/pGXmTSST基因工程菌用IPTG诱导表达,经超声波破碎、离心、收集上清再用谷胱甘肽琼脂糖凝胶柱(GS4B)亲和层析纯化金黄色葡萄球菌无毒诱变GST-mTSST-1融合蛋白.以SDS-PAGE分析该融合蛋白的表达量和纯度,经双向免疫琼脂扩散试验鉴定GST-mTSST-1融合蛋白的免疫活性.结果表明,GST-mTSST-1融合蛋白在重组菌中可溶性表达,通过GS4B胶亲和层析纯化,SDS-PAGE电泳分析得到纯度较高的目的蛋白,其相对分子质量约为47 000,与理论值一致.兔抗GST-mTSST-1抗血清可特异识别天然rTSST-1蛋白中与GST-mTSST-1融合蛋白相对应的抗原组份,证实GST-mTSST-1融合蛋白具有与野生型rTSST-1相同的表面抗原决定簇,具有较好的免疫原性.     

血管生成抑制因子arresten克隆及功能的初步研究

血管生成抑制因子arresten是血管生成及肿瘤生长抑制物.研究发现,将arresten基因重组于质粒pGEX4T1转化入大肠杆菌BL21并用IPTG诱导蛋白表达,可获得分子量为45kDa的目的蛋白条带,arresten蛋白多数以包涵体形式存在,也有可溶蛋白存在于菌裂解液的上清,可溶蛋白可由Sepharose 4B凝胶柱亲和层析柱纯化.在鸡胚绒毛尿囊膜(chick chorioallantoic membrane,CAM)实验中,arresten基因可溶蛋白被证实抑制新生血管生成的效果较好.