大肠杆菌K88ac-ST1-LTB融合蛋白多价卵黄抗体的制备

对已构建的重组菌株BL21(DE3)(pETXKSL3)进行鉴定,酶切鉴定证实重组质粒pETXKSL3含有K88ac-ST_1-LT_B融合基因且阅读框架正确.Western blot分析表明K88ac-ST_1-LT_B融合蛋白能够被ST_1单抗、K88ac和LT_B抗体识别.以K88ac-ST_1-LT_B融合蛋白为抗原免疫蛋鸡制备卵黄抗体,ELISA法测定卵黄抗体效价可达1∶13 200.仔猪攻毒实验表明制备的卵黄抗体对仔猪黄痢和仔猪白痢的预防有效率为96%,上述研究结果说明K88ac-ST_1-LT_B多价卵黄抗体对由ETEC引起的新生仔猪腹泻具有很好的预防效果,从而为最终开发出一种新型高效、可替代抗生素的防治新生仔猪大肠杆菌性腹泻的特异性卵黄抗体生物防治制剂打下坚实基础.     

产毒素大肠杆菌LTB-K99融合基因的构建

利用PCR技术从原始菌种中扩增得到K99和LTB基因,将K99和LTB基因连接起来,构建了LTB-K99融合基因.融合基因克隆到pBS-T载体上,转化大肠杆菌top10,经Bam HI和Xho I双酶切鉴定重组质粒.测序分析结果表明,该融合基因有正确的阅读框,为以后转入表达载体的构建奠定了基础.     

大肠杆菌菌毛抗原K88与热稳定肠毒素ST融合基因植物表达载体的构建及其在烟草中的初步表达

利用DNA重组技术,将编码大肠杆菌黏附素蛋白K88与热稳定肠毒素ST的融合基因的序列片段克隆到植物表达载体pCANBIAl3O2中,成功地构建了植物重组表达质粒pCANBIA—K88-ST,并将其转化农杆菌EHAl05．利用农杆菌介导法转化烟草,并初步获得转化体。为K88-ST基因的进一步研究奠定了基础。     

携带大肠杆菌融合基因K88ac-STII的减毒鼠伤寒沙门疫苗菌的构建与鉴定

为构建表达大肠杆菌菌毛蛋白K88ac和热稳定肠毒素STII的无抗性减毒鼠伤寒沙门氏菌疫苗株,采用缺失腺苷酸环化酶基因(Δcya)、环腺苷酸受体蛋白基因(Δcrp)以及天冬氨酸β-半醛脱氢酶基因(Δasd)的鼠伤寒沙门菌(X4550)作为宿主,将编码K88ac-STII的融合基因插入Asd 组成型表达载体pYA3334中,通过2次转化引入宿主菌,成功构建了表达K88ac-STII融合基因平衡致死的减毒鼠伤寒沙门重组菌株S.typhimuriumX4550(pYA3334K88ac-STII),为防治仔猪腹泻提供了口服活菌疫苗候选株。     

大肠杆菌中融合表达汉滩病毒S,M基因片段的研究

为在大肠杆菌中融合表达汉滩病毒囊膜糖蛋白G1与NP含主要抗原位点的片段 .将汉滩病毒 76 118株S基因编码区 5′端约 0 .7kb的片段与M基因编码G1的片段连接 ,克隆入 pGEX 4T2 ,构建嵌合基因原核表达载体 pGEX 4T2 S 0 .7G1,在大肠杆菌XL1 Blue中诱导GST S0 .7G1融合蛋白的表达 .表达产物用ELISA和Westernblot进行鉴定 .限制性内切酶酶切鉴定证明 ,成功构建了嵌合原核表达载体 pGEX 4T2 S0 .7G1.经IPTG诱导后 ,ELISA活性测定结果表明 ,该融合蛋白可与抗汉坦病毒NPmAb特异性结合 .Westernblot结果显示 ,诱导出相对分子质量 (Mr)大于 1× 10 5的S0 .7G1与GST的融合蛋白 ,并有一系列大小不等的可与抗汉坦病毒NPmAb特异性结合的蛋白带 .获得具有特异性结合活性的融合蛋白GST S0 .7G1,为汉滩病毒基因工程疫苗的研制奠定了基础     

化学合成的α—降钙素基因相关肽基因在大肠杆菌中的融合表达 …

化学法合成的α－降钙素基因相关肽基因从ｐＸＺ１０１有达质粒转移到ＰＵＣ１８质 测序鉴定后,克隆到ＰＧＥＸ表达载体上,在大肠杆菌Ｃ６００中表达。     

大肠杆菌菌毛抗原K99基因的亚克隆及核苷酸序列测定

利用PCR技术 ,从含有大肠杆菌菌毛抗原K99基因的质粒pX5K中扩增出 0 .4kb的K99菌毛抗原基因 ,然后将其亚克隆到pGEM T easy载体上 ,并转化至受体菌JM10 9中 ,采用碱性裂解法提取质粒DNA后 ,经NcoI和EcoRⅠ双酶切分析和核苷酸序列分析 ,证明插入的K99基因片段具有正确的核苷酸序列     

人纤溶酶原K1—3区基因在大肠杆菌中的表达

将人纤溶酶原Krigle 1-3(K1-3)基因插入融合表达载体pET-17b,获得重组质粒pET-K13,转化E.coli BI21(DE3),在IPTG诱导下,人纤溶酶原K1－3基因在E.coli BI21(DE3,pET-K13)中获得高效融合表达,表达量占菌体总蛋白的24％,表达产物以包函体存在,Western blot证明重组 蛋白对人纤溶酶原抗血清有特异免疫原性。     

大肠杆菌K12碱性磷酸酶基因的克隆表达

大肠杆菌碱性磷酸酶是同二聚体金属酶，被phoA基因编码．采用PCR方法从大肠杆菌K12中扩增到碱性磷酸酶基因（phoA）．用限制性内切酶BamHI和HindⅢ将片段插入克隆载体pETBlue-2．该基因被重组、转化后在大肠杆菌中经IPTG诱导表达，而后进行SDS-PAGE检测及紫外吸收分析测OD410．克隆得到了phoA基因并实现了蛋白表达，碱性磷酸酶的活性提高了18，3倍，为进行组织化学、免疫印迹、突变分析等工作打下了坚实的基础．     

人类8型疱疹病毒K1基因真核表达载体的构建

为构建人类8型疱疹病毒(Human herpesvirus 8,HHV-8)K1基因的真核表达载体,采集卡波氏肉瘤(Kaposi's sarcoma,KS)患者血清,采用柱式病毒DNA抽提试剂盒抽提血清中的病毒DNA,采用套式PCR技术检测HHV-8的特异性片断KS330233以判断是否得到了HHV-8 DNA,采用PCR技术扩增HHV8 K1基因并纯化回收,酶切、连接入真核表达载体pcDNA3.1,转化大肠杆菌DH5α,挑取阳性克隆pcDNA3.1/HHV8-K1扩增后,提取质粒,进行双酶切和DNA测序鉴定.结果显示采集了经典型KS血清3例,提取了血清HHV-8DNA,扩增了特异性片断KS330233,测序结果正确提示我们得到了HHV8 DNA,扩增了HHV8 K1基因,构建了pcDNA3.1/HHV8-K1真核表达载体,经限制性内切酶酶切鉴定及测序分析证实了其序列的正确性.由此可知:成功构建了pcDNA3.1/HHV8-K1真核表达载体,为进一步研究该基因的功能奠定良好的实验基础.     

耐热型产肠毒素大肠杆菌检测方法的建立及应用

为建立检测产肠毒素大肠杆菌(ETEC)耐热型肠毒素STa和STb的纳米金PCR方法,根据ETEC耐热型肠毒素STa和STb的基因序列,用Primer 5.0软件设计了2对特异性引物,优化得到最佳反应条件,并进行灵敏度和特异性的测试.实验结果表明:本文所建立的体系均能扩增到目的条带,灵敏度为47.5 cfu/mL,且特异性良好;所建立的纳米金PCR方法在人工染菌实验中也获得了较高的灵敏度和特异性.     

肠毒性大肠杆菌的绿色荧光蛋白转化及表达研究

通过电击转化法,将带有gfp标记基因的pGLO质粒成功转化到肠毒素型大肠杆菌K88、K99中,经过紫外检测及荧光显微镜检测均发现转化菌株发出绿色的荧光,表明gfp基因得到稳定、高效的表达.进一步通过PCR分子鉴定、血清型鉴定、微生物学特性分析均表明,转化菌株与原始菌株是一致的.该转化菌株将为研究肠毒性大肠杆菌的致病机理及益生素的筛选提供有效的手段.     

肠毒性大肠杆菌的绿色荧光蛋白转化及表达研究

通过电击转化法，将带有gfp标记基因的pGLO质粒成功转化到肠毒素型大肠杆菌K88、K99中，经过紫外检测及荧光显微镜检测均发现转化菌株发出绿色的荧光，表明gfp加基因得到稳定、高效的表达．进一步通过PCR分子鉴定、血清型鉴定、微生物学特性分析均表明，转化菌株与原始菌株是一致的．该转化菌株将为研究肠毒性大肠杆菌的致病机理及益生素的筛选提供有效的手段．     

人肠激酶轻链基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

研究目的：克隆表达人肠激酶轻链编码基因,以期应用于融合蛋白的切割与纯化．方法：从人的全基因组中扩增出编码人肠激酶轻链的5个外显子基因片段,经过酶切、连接后得到正确编码的人肠激酶轻链完整基因序列;随后,将目的基因片段插入原核表达载体pBV220中,构建成融合型表达载体pBV—EKL,转化大肠杆菌BL21（DE3）,调节温度至42℃诱导重组蛋白表达;通过镍亲和层析纯化得到重组蛋白．结果：所表达的重组蛋白经SDS—PAGE分析,相对表观分子质量约为31kDa,表达量占菌体总可溶蛋白量的46％;通过镍亲和层析纯化得到的重组蛋白经复性后显示出具有催化切割活性．结论：成功构建了能大量表达重组人肠激酶轻链的菌株,为进一步进行重组人肠激酶活性的研究及其在生产和医学方面的应用研究奠定了基础．     

大肠杆菌麦芽糖转糖基酶 MalQ基因克隆与融合表达

用PCR方法获得E.coli K12 MalQ基因,将该基因插入原核表达载体pET-DsbA中,对质粒所含外源片段双向测序,并经BLAST比较分析,发现其与GenBank中报道的E.coli K12 MalQ基因的同源性高达99％。重组质粒转化E.coli BL21(DE3) plysS,经IPTG诱导后以融合蛋白形式表达,SDS-PAGE电泳显示MalQ基因与DsbA表达的融合蛋白在目标位置约103kDa处有明显条带。经薄层层析分析粗酶液酶处理的麦芽三糖溶液,证实粗酶液具有麦芽糖转糖基活性