逆转录病毒感染结合流式细胞分选方法构建稳定过表达CUEDC2的MCF-10A细胞系

CUEDC2（CUE domain containing protein 2）是本实验室发现的功能未知蛋白质。已有研究证明CUEDC2通过抑制孕激素受体PR影响乳腺癌细胞的生长,同时CUEDC2的高表达能够降解雌激素受体ER而导致乳腺癌内分泌治疗耐药。为了深入研究CUEDC2在乳腺癌中的功能,我们构建了稳定过表达CUEDC2的MCF-10A细胞系。利用逆转录病毒将非融合形式的绿色荧光蛋白质GFP和CUEDC2基因稳定整合至靶细胞的基因组中,经过流式分选获得GFP阳性细胞,即为稳定表达CUEDC2的细胞株。上述方法高效快捷,极大提高了稳定细胞株的构建效率。同时该稳定细胞株的建立为CUEDC2的功能研究提供了必要的工具。     

CUEDC1的克隆表达及其对PRB和ERα转录活性的影响

为了研究CUE Domain Containing 1 (CUEDC1)蛋白质功能,构建了pcDNA3.0-Flag-CUEDC1表达载体,并且成功表达Flag-CUEDC1蛋白质.通过双荧光报告系统,对比CUEDC1与CUEDC2对PRB和ERα转录活性的影响.其结果显示,CUEDC2能够抑制PRB和ERα转录活性,而CUEDC1对PRB和ERα转录活性的影响不显著.     

Tet-on系统诱导乳腺特异表达CUEDC2转基因小鼠的制备

目的：建立Tet-on系统诱导乳腺特异表达CUEDC2的转基因小鼠模型。方法：构建转基因表达载体,经细胞诱导表达验证后,酶切得到含有CUEDC2的线性DNA片段,并采用显微注射的方法及后续筛选鉴定,得到CUEDC2转基因小鼠。进而通过与乳腺特异表达的MMTV-rtTA转基因小鼠交配,得到CUEDC2/rtTA双阳性转基因小鼠。利用2mg/ml的多西环素（Doxycycline）诱导小鼠体内CUEDC2表达,通过Western Blot、免疫组化检测表达。结果：经诱导,CUEDC2/rtTA双阳性转基因小鼠的2个Founder的F1、F2代在转录水平和蛋白水平均成功表达CUEDC2, 并具有乳腺特异性。结论：Tet-on系统诱导乳腺特异表达CUEDC2的转基因小鼠制备成功.     

CUEDC1抑制TNFalpha激活的AP-1的转录活性

为了研究CUEDC1蛋白质是否参与了AP—1信号通路,首先在真核细胞中成功表达了Flag—CUEDC1蛋白质,通过双荧光报告系统,研究了CUEDC1对AP—1信号通路的影响。结果显示,过表达CUEDC1能够显著抑制TNFα激活的AP—1转录活性,而对IFNα激活STAT3的转录活性没有影响,并且CUEDC1抑制AP—1转录活性影响是发生在TRAF2分子或者上游水平。     

用体外转录法制备小干扰RNA抑制Hela细胞CUEDC2基因表达

CUEDC2是一个广泛表达于各种真核生物、功能尚不明确的基因.利用一种改进的体外转录方法获得包含CUEDC2基因靶序列的长链RNA,进而通过RNA酶H切割引导序列形成成熟siRNA.转染Hela细胞并进行免疫印迹检测.结果显示,运用此方法得到的siRNA能够有效地抑制细胞中内源CUEDC2的表达,此项方法为CUEDC2的深入功能分析奠定了基础.     

CUEDC1抑制TNFα激活的AP-1的转录活性

为了研究CUEDC1蛋白质是否参与了AP-1信号通路,首先在真核细胞中成功表达了Flag-CUEDC1蛋白质,通过双荧光报告系统,研究了CUEDC1对AP-1信号通路的影响.结果显示,过表达CUEDC1能够显著抑制TNFα激活的AP-1转录活性,而对IFNα激活STAT3的转录活性没有影响,并且CUEDC1抑制AP-1转录活性影响是发生在TRAF2分子或者上游水平.     

CUEDC1氨基酸保守性分析及抑制TGF-beta /Smad转录活性

为了分析CUEDC1氨基酸保守性和研究CUEDC1蛋白质影响TGF-beta/SMAD信号通路的转录活性,用软件分析比较CUEDC1的氨基酸序列和通过双荧光报告系统测定TGF-beta/SMAD转录活性。结果显示cue结构域在人、小鼠和大鼠之间相似性为100%和过表达CUEDC1能够抑制TGF-beta/SMAD转录活性。     

CUEDC2突变体的构建及在原核和昆虫表达系统中的表达

目的：构建CUEDC2的突变体并在原核和昆虫表达系统中表达验证。方法：根据人cuedc2序列设计引物,以其突变体质粒为模板PCR扩增目的片段,酶切后连接至pET28a原核表达载体以及pFastBac1-Flag-N和pFastBac-HTA昆虫表达系统的表达载体,转化至DH5α后提取质粒,经菌液PCR、测序鉴定后,转入大肠杆菌BL21(DE3)及DH10Bac感受态细胞中。原核表达载体在E.coli中表达后用Ni-NTA亲和纯化,SDS-PAGE检测。昆虫表达载体提取杆粒,转染至昆虫细胞Sf9中表达,最后用western 进行鉴定。结果：成功构建了CUEDC2的突变体,并在原核和昆虫表达系统中表达。结论：在原核和昆虫表达系统中,成功表达的CUEDC2突变体蛋白为CUEDC2的结构和功能研究奠定了基础。     

肥大细胞调控IDO诱导的肺癌细胞转移

建立了小鼠肥大细胞体外诱导体系。探究肥大细胞对肿瘤细胞侵袭转移能力的影响。Transwell迁移和侵袭实验检测了与肥大细胞共培养后的细胞2LL侵袭转移能力变化。实验结果表明:肥大细胞能够抑制IDO诱导的细胞2LL的侵袭转移能力。生物信息学分析发现基质金属蛋白酶抑制剂-1(TIMP1)能够抑制促肿瘤转移的基质金属蛋白酶-1(MMP1)、基质金属蛋白酶-2(MMP2)以及基质金属蛋白酶-9(MMP9)的表达。Western blot结果表明肥大细胞通过抑制STAT3磷酸化而减少IDO的表达;并通过TIMP1信号通路抑制MMP2、MMP9和VEGF的表达。这些结果表明肥大细胞通过抑制STAT3信号通路磷酸化调控IDO表达和抑制下游TIMP1、MMP2、MMP9信号通路抑制细胞2LL转移能力。     

OsNAC2转录因子介导生长素代谢通路调节水稻早期根的发育

NAC家族是植物特有的一类转录因子,在植物的生长发育和逆境胁迫等方面具有重要的功能.研究发现,OsNAC2基因的过表达(ON11)和RNAi(RNAi31)转基因株系,早期主根的长度有显著变化的特征.与野生型日本晴水稻(WT)相比,ON11植株的主根变短,而RNAi31的主根变长.通过对早期OsNAC2pro∶∶GUS株系根尖染色结果表明OsNAC2在根尖具有时序性表达.不同激素诱导OsNAC2表达谱和OsNAC2pro∶∶GUS株系对激素响应结果显示OsNAC2受生长素显著性诱导.结合芯片数据和qRT-PCR分析,OsNAC2转基因株系中生长素合成代谢及信号通路相关基因表达量变化较为明显.同时,ON11根尖淀粉粒发育及其向重力性受到抑制.因此,推测OsNAC2可能通过抑制生长素的合成代谢及信号通路相关基因的表达,降低生长素含量,并参与生长素响应通路,最终影响水稻根的生长.     

试论日语表达的特点——静态的表达

静态表达是日语颇为独特的一种表达方式。文章运用语言实例进行日、汉两种语言的对比分析，探讨以事物的自然结果为基础而构成的日语静态表达的实质，彰显其强调事物的客观存在、自然发生的作用的表达特点，揭示日本人的语言心理及思维方式。     

一种将中缀表达式转换为后缀表达式的新方法

中缀表达式是一种常见的表达式形式,对它进行求值时,既要考虑操作符的优先级,又要考虑操作符的结合性,虽然在直观上判断一个中缀表达式的运算次序并不难,但如果用计算机处理就非常困难,其一般做法是先将中缀表达式转换成后缀表达式再求值.在已有方法的基础上提出一种将中缀表达式转换为后缀表达式的新方法.     

真核生物多顺反子表达载体的构建及在Hela细胞中的表达

利用DNA重组技术将抗肿瘤血管生成的内皮抑素基因endostatin插入含有FHIT(抗肿瘤人脆性组氨酸三联体基因)和EGFP的pIRES2-FHIT-EGFP载体中构建了真核多顺反子表达载体pES-IRES-FHIT-IRES-EGFP,用脂质体法转染Hela细胞后,用G418筛选出稳定转染的细胞.经RT-PCR、RT-PCR southern blot、northern blot和免疫细胞化学分析,结果证明单顺反子和三顺反子在RNA水平都得到表达.在蛋白表达水平上,荧光观察和免疫细胞化学分析结果显示Endostatin、FHIT和EGFP在Hela细胞中均得到表达,为基因药物和肿瘤多基因治疗奠定了基础.     

bFGF真核表达载体构建及表达

旨在构建可在哺乳细胞中表达碱性成纤维细胞生长因子（basic Fibroblast Growth Factor,简称bFGF）的真核表达载体，以便用于研究bFGF基因治疗在骨组织工程中的应用，应用基因重组技术，将已经克隆的bFGF基因从PBR322－bFGF载体上亚克隆到真核表达载体pcDNA3．1上，构建的重组质粒经脂质体介导转染3T3细胞，36h后观察瞬时表达情况，酶切，PCR和DNA测序结果均证实了插入片段的正确性，免疫组织化学检测bFGF的表达分泌情况，结果显示部分经转染的细胞呈阳性（棕色颗粒）。结果表明已成功构建了bFGF真核表达载体pcDNA3.1-bFGF，并且bFGF能够在3T3细胞表达。     

略论树立科学发展观

科学发展观的核心就是强调人与社会的和谐与统一,实现社会的全面、可持续的发展.我们要努力把握发展的客观规律,汲取人类关于发展的有益成果,要把实现人民群众的利益作为追求政绩的根本目的,把党和人民的需求作为评价政绩的重要尺度,在科学的发展观的指导下实现我国社会的全面发展.     

Newton公式和Waring公式的等价性的讨论

本文研究了Newton公式和Waring公式的关系,揭示了两公式之间的内在联系,得到了一个重要的结论.     

Newton公式和Waring公式的等价性的讨论

本文研究了Newton公式和Waring公式的关系,揭示了两公式之间的内在联系,得到了一个重要的结论。     

人胰岛素基因重组杆状病毒在家蝇中表达的研究

目的利用杆状病毒表达系统进行人胰岛素基因在家蝇中表达的研究.方法用携带有人胰岛素基因的重组杆状病毒感染家蝇幼虫,用放射免疫技术、Tricine-SDS-PAGE和Western-blot技术对蝇蛆胰岛素表达水平进行检测.结果重组的杆状病毒感染家蝇幼虫后,蝇蛆中有人胰岛素的表达,表达量为37.401μIU/mL,占蝇蛆总蛋白的0.583%.结论利用杆状病毒表达系统可以在家蝇蝇蛆中表达人胰岛素.