肝癌细胞株HepG2的G1期、G2／M鞋细胞蛋白质组表达差异的研究

通过TdR（胸腺嘧啶核苷）调控人肝癌细胞株HepG2的细胞周期，运用双向电泳-图像分析-质谱技术研究肝癌细胞株HepG2的G1期、G2／M期全细胞蛋白质组表达的差异，探索参与肝癌细胞株HepG2的G1期、G2／M期调控相关的蛋白。以TdR诱导肝癌细胞株HepG2，分别得到同步化的G1期、G2／M期细胞，流式细胞术检测。采用比较蛋白质组学的研究技术（双向电泳、质谱分析）筛选G1期、G2／M期差异表达的蛋白质。结果流式细胞术检测显示TdR诱导后，分别获得（63．62±2．82）％的G2／M期同步化细胞，（75．24±0．17）％的G1期同步化细胞，通过双向电泳-图像分析-质谱技术得到21个差异表达的蛋白。其中G2／M期表达，G1期未见表达有10种蛋白；存在三倍以上的差异点11个：2种在G2期表达上调，9种在G1期表达上调。说明TdR阻断法能够获得很好的同步化细胞。质谱鉴定得到的这些差异表达的蛋白质涉及到细胞周期调控、DNA结合、转录调控、mRNA剪接、肽链合成起始、折叠以及细胞代谢等方面。     

TdR诱导肝癌细胞株HepG2细胞周期同步化的效果

取对数生长期的 HepG2 细胞,加入含 TdR 的培养基 28 h 后,收集细胞,用 PBS 洗2次,加完全培养基,分别于 12 h 和24 h 收集各组细胞.用流式细胞术分析细胞周期各时相细胞百分数.探讨 TdR(胸腺嘧啶核苷)诱导人肝癌细胞株 HepG2 同步化后的细胞周期时相的变化.结果是TdR能较好地使肝癌细胞株Hepc2同步化于G1期和G2期.TdR诱导细胞后,分别于12中 h 获得(63.62±2.82)%的 G2/M 期同步化细胞,24 h 后获得(75.24±0.17)%的G1期同步化细胞.     

肝癌细胞株HepG-2的G1期细胞蛋白质组双向电泳图谱的建立

采用双向电泳分离肝癌细胞株 HepG2 的 G1 期细胞的蛋白质,经考马斯亮蓝染色及图像扫描与分析显示:在 pH3-10,13 cm 的 IPG 胶条上,可分离到 227 个重复性及分辨率均较好的蛋白斑点,蛋白斑点的匹配率为 84%.建立了 HepG2 的G1 期细胞蛋白质组双向电泳图谱,为其蛋白质组学的进一步研究奠定了基础.     

白藜芦醇诱导HepG2细胞凋亡中线粒体差异蛋白鉴定

为研究线粒体在白藜芦醇诱导人肝癌细胞系HepG2细胞凋亡中的作用机制。分离提取白藜芦醇处理的HepG2细胞及对照组细胞的线粒体蛋白质,双向电泳分离差异蛋白质,飞行时间质谱鉴定差异蛋白点,摸索并建立了一种有效分离提取细胞线粒体蛋白质和双向电泳的方法。初步分析鉴定了四个显著性差异蛋白,着丝粒蛋白Kinesin protein和CENP-E降低,证明白藜芦醇对细胞周期及细胞骨架的调节作用,Peptidase (mitochondrial processing)表达降低,线粒体核糖体蛋白L7/L12（Mitochondrial ribosomal protein L7/L12, MRP L7/L12）表达升高,表明白藜芦醇诱导HepG2细胞与其对线粒体功能的影响有关。     

白蔡芦醇诱导HepG2细胞凋亡中线粒体差异蛋白鉴定

文中分离提取白慕芦醇处理的HepG2细胞线粒体蛋白质,以未处理HepG2细胞为对照,利用双向电泳技术分离差异蛋白,飞行时间质谱分析鉴定差异蛋白点初步分析鉴定了4个显著性差异蛋白,其中驱动蛋白和着丝粒相关蛋白(:ENP-E在白慕芦醇处理的HepG2细胞中表达降低,证明白慕芦醇对细胞周期有调节作用;线粒体加工肤酶表达降低,线粒体核糖体蛋白L7/L12表达升高,说明白慕芦醇诱导HepG2细胞凋亡与其影响线粒体功能有关     

齐墩果酸联合放疗对HepG2细胞周期和凋亡作用的体外研究

目的体外观察齐墩果酸(oleanolic acid,OA)联合放疗对肝癌HepG2细胞周期和凋亡的影响,探讨OA的放射增敏作用及其机制.方法对数生长期HepG2细胞分为对照组、单纯给药组(OA组)、单纯照射组(IR组)、照射与药物联合作用组(IR+OA组).MTT法检测细胞活力,Hoechst33258染色观察细胞凋亡形态学变化,流式细胞仪检测细胞周期和凋亡,Western blotting检测细胞周期相关蛋白表达.结果 OA显著增加射线的杀伤作用,联合组细胞的活力明显下降,凋亡率增高,细胞周期蛋白CyclinB1和Cdk1的降低,p-Cdk1表达量上升更明显,细胞G2/M期阻滞明显高于对照组(P0.05).结论 OA显著增加射线对肝癌细胞的杀伤作用,其机制可能与CyclinB1-Cdk1复合物的表达量减少和活性抑制、诱导细胞阻滞G2/M期有关.     

淫羊藿素对不同p53分型顺铂耐药卵巢癌细胞株周期阻滞作用的研究

目的:研究淫羊藿素(ICT)对不同p53分型顺铂耐药卵巢癌细胞株的增殖抑制作用及机制,为复发耐药性卵巢癌治疗药物的研发提供新思路.方法:利用胸腺嘧啶核苷酸(TdR)双阻滞法建立周期同步化模型,采用流式细胞技术检测淫羊藿素对同步化后的不同p53分型顺铂耐药卵巢癌细胞株的细胞周期阻滞作用,Western blot检测浓度为20μmol/L淫羊藿素作用下细胞株周期蛋白CyclinE、CyclinB1、p53及CHK1蛋白表达情况.结果:淫羊藿素浓度为20μmol/L作用4 h时即产生周期阻滞作用,阻滞效果随作用时间延长而增强;其中,p53野生型C13~*细胞株G1期百分比升高(P0.05);p53变异型A2780cp细胞株G2期百分比升高(P0.05);p53缺失型的SKOV3细胞株G2期百分比升高(P0.05).淫羊藿素20μmol/L作用下,p53野生型C13~*细胞株CyclinE表达下调,而CyclinB1蛋白无明显变化;p53变异型A2780cp及p53缺失型SKOV3细胞株CyclinB1蛋白表达下调,而CyclinE无明显变化.p53野生型C13~*细胞株p53蛋白表达明显上调,p53变异型A2780cp细胞株p53蛋白无明显变化,p53缺失型SKOV3细胞株p53蛋白表达缺失;三株细胞CHK1蛋白表达均明显升高.结论:淫羊藿素对不同p53分型顺铂耐药卵巢癌细胞均具有时间依赖性的周期阻滞作用;其对不同p53分型顺铂耐药卵巢癌细胞的阻滞作用途径不同;其中对p53野生型C13~*细胞株通过p53途径下调CyclinE蛋白诱发细胞G1期阻滞;而对p53突变型A2780cp及p53缺失型SKOV3细胞株则通过CHK1途径下调CyclinB1诱发G2期阻滞.     

皮蛋模拟胃肠道消化物对HepG2细胞的影响

皮蛋是中国传统食品,其水解物具有抗氧化、抗炎和抗癌等功效,具有良好的医学前景,但目前皮蛋发挥抗癌功效的途径及作用机制尚不清楚。探究了皮蛋模拟胃肠道消化物(preserved eggs simulated gastrointestinal digests,PESD)对人肝癌HepG2细胞增殖和细胞周期的影响。将皮蛋经体外模拟胃肠道消化处理后,进行细胞实验,用CCK-8法进行细胞增殖分析,研究PESD对HepG2细胞存活率的影响,采用碘化丙啶(propidium iodide, PI)染色标记的方法,通过流式细胞术测定PESD对HepG2细胞周期的影响,用western blot法测定细胞周期相关调控蛋白的表达。研究发现:PESD以剂量依赖性方式对HepG2细胞增殖进行抑制,IC₅₀为4.17mg/mL;PESD处理显著增加了S期细胞的占比(P<0.05),使HepG2细胞阻滞于S期;4mg/mL的PESD处理HepG2细胞24h后,细胞中cyclin A、cyclin E、ATM、chk2和CDC25A的蛋白表达水平上升(P<0.05),而CDK2蛋白表达水平下降(P<0.05)。研究认为,皮蛋模拟胃肠道消化物是以剂量依赖性的方式来抑制人肝癌HepG2细胞的增殖,主要是通过ATM-chk2-CDC25A信号通路,上调cyclin A和cyclin E蛋白的表达,下调CDK2蛋白的表达来实现人肝癌HepG2细胞阻滞于S期,影响人肝癌HepG2细胞周期进程,抑制癌细胞的增殖。研究结果旨在为皮蛋抗癌作用机制的阐明提供一定的理论基础。     

MTA1基因在肝癌细胞系HepG_2及其异质性亚系中表达的差异性

目的:探讨MTA1基因在肝癌细胞系HepG2及其异质性亚系中的表达水平.方法:采用半定量RT-PCR、荧光定量RT-PCR的方法检测3种细胞中MTA1基因的表达差异;Western blotting检测蛋白水平的表达差异;用细胞免疫组织化学方法观察MTA1蛋白的细胞定位.结果:HepG2-H和HepG2细胞株的mRNA和蛋白表达水平均高于HepG2-L细胞株;细胞免疫组化显示3株细胞的MTA1蛋白均定位于细胞核和细胞浆,以细胞核为主.结论:MTA1基因在具有不同转移潜能的肝癌细胞亚系HepG2-H、HepG2-L中的表达具有明显差异.     

龙葵碱诱导HepG2细胞凋亡的观察

观察龙葵碱对3种消化系统肿瘤细胞株人肝癌细胞HepG2、人胃癌细胞SGC-7901、人大肠癌细胞Ls-174的细胞毒作用.并从细胞凋亡角度揭示龙葵碱对敏感细胞株的作用机制.采用MTT法观察龙葵碱对3种肿瘤细胞株的细胞毒作用;采用AO/EB双染,激光共聚焦扫描显微术(confocal)观察龙葵碱对HepG2肿瘤细胞形态的影响;PI单染,流式细胞仪测定龙葵碱诱导HepG2细胞凋亡的凋亡率及对细胞周期的影响.龙葵碱作用于HepG2、SGC-7901、LS-174的IC50分别为14.47μg/mL、(50μg/mL、(50μg/mL;在形态学观察实验中,阴性对照组细胞形态正常,0.003 2μg/mL、0.016μg/mL龙葵碱使细胞外周呈微弱皱缩状改变,0.08、0.4、2μg/mL龙葵碱使HepG2细胞出现大量碎片及凋亡小体等典型的细胞凋亡形态.凋亡率测定结果表明5个剂量龙葵碱诱导HepG2细胞凋亡率分别为6.0%、14.4%、17.3%、18.9%、32.2%,0.08μg/mL喜树碱诱导HepG2细胞的凋亡率为21.9%.细胞周期观察发现龙葵碱各组G2/M期均消失,S期明显升高.龙葵碱对HepG2人肝癌细胞株比较敏感,能够诱导HepG2细胞凋亡,并将HepG2细胞阻止在S期,影响肿瘤细胞DNA合成.     

Effect of P15INK4b expression on the cell cycle and G1 phase related regulatory genes in human melanoma cells

Using the transfeetion teehnique. P15INK4b was introduced into P15INk4b gene deleted human melanoma A375 cells,and a cell model MLED6 overexpressing P15INK4b WAS CONSTRUCTED.Comparing with the control cells MLC2,MLEK6cells in G1phase increased by 11%,but those in Sphase decreased by 15%by FCM.By the method of thymidine(TdR)and N2O arresting,the proportions of synchronized Mphase cells of MLEK6 ana MLC23 were measured and found to be 89.1% and 76.8%respectively ,and the cells in G1phase were 74.3% for MLID6 AND 76. 4% forMLC2.The result of3 H-TdR incorporation indicated that the transition of G1/Sof MLEK6 cell was delayed 2h as compared with that of MLC2 cells,and incorporation rate also decreased.The observation on exprissions of some G1/ S-resates relatory rigusating genes showed that in MLIK6 cells the protein leves of P27KIPI increased with the decreasing expressions of cyclinD1,cyclinE and c-myc,especially cyclinD1 in late G1phade.The expression of cyclinE obviously decreased at G1/S transition ,and c-myc wad inhibited throughout all the process of G1 S phase.All the risults suggest that P15INK4b can delayG1/S transition of MLEK6 cells by inhibiting the cell cycle engine ,and by increasing the expression of Cdk ingibitor P27KIPI in different stages of G1 phase.     

KLF4沉默与阿霉素诱导的DNA损伤协同抑制肝癌HepG2细胞的生长

探究KLF4沉默与经不同作用浓度阿霉素处理诱导的DNA损伤对肝癌HepG2细胞增殖凋亡的影响及其作用机制.应用RNA干扰技术,采用siRNA转染HepG2细胞以沉默KLF4基因.采用MTT法检测KLF4沉默前后对HepG2细胞增殖的影响,使用流式细胞术检测KLF4沉默前后对HepG2细胞周期变化影响,应用Western blot法检测转染前后HepG2细胞中KLF4蛋白及细胞周期相关蛋白表达变化.Western blot检测到高浓度的阿霉素促进KLF4的表达,并且低浓度的阿霉素可使得细胞停滞在G2/M期,高浓度的阿霉素则使部分细胞凋亡(19.31%).将KLF4沉默后,发现细胞生长变缓,低浓度的阿霉素处理后,细胞随时间增加而出现更多的细胞凋亡;高浓度的阿霉素处理后,细胞数明显减少,更多的细胞发生凋亡(28.89%),且在KLF4沉默前后均发现低浓度阿霉素促进p53与p21表达,高浓度阿霉素抑制其表达.阿霉素诱导的DNA损伤可提高KLF4的表达,KLF4依赖于DNA损伤激活的p53促进p21的表达,进而引起G1/S期细胞周期阻滞.沉默KLF4与阿霉素诱导的DNA损伤可协同抑制肝癌细胞的增殖、促进凋亡,其在肝癌细胞 HepG2中扮演十分重要的角色.     

百草枯对人肝HepG2细胞生长和周期的影响

为全面理解百草枯(PQ)对人肝的毒性效应,寻找新的方法增强肝对PQ的解毒能力,本文采用显微观察和流式细胞术分析了PQ处理24h对人肝HepG2细胞生长和周期的影响.结果显示,7.21mg/L的PQ处理即可抑制部分HepG2细胞的生长,23.36mg/L的PQ可导致HepG2细胞周期停滞,S期细胞明显减少、G1和G2期细胞明显增多,且细胞生长抑制和周期受阻程度与PQ处理浓度呈正相关.该结果表明,PQ对HepG2细胞的生长和周期具有明显阻滞作用,生长因子类或促增殖类药物可能有助于增强人肝对PQ的解毒能力.     

Partial inhibition of CDK4 gene expression leads to the extension of G1 phase of V79-8 cells

V79-8 is an abnormal cell line which does not have detectable G1 and G2 phases in its cell cycle. This cell line is derived from V79 cell line which has Gl phase but lacks G2 phase. By using an anti-sense approach, CDK4 gene expression was partially inhibited to find whether CDK4 might contribute to the lack of Gl phase in V79-8 cells. Anti-CDK4 anti-sense plasmid was constructed and used to transfect V79-8 cells. Clones of transfected cells (V79-8-asCDK4) were examined, in comparison with V79-8 cells, to determine its growth curve, cell doubling-time (GT), the level of CDK4 gene expression and the levels of expression of some other growth related genes. V79-8-asCDK4 cells showed a slower growth rate with a doubling time 2.5-h longer than that of V79-8 cells. A flow cytometry (FCM) analysis demonstrated that the 2.5 h increase of the doubling time of V79-8-asCDK4 cells was mainly due to the appearance of Gl phase because its G2 + M phase was not significantly different from that of V79-8 cells. The decrease of CDK4 gene expression in V79-8-asCDK4 cells was shown by Northern-blot. Changes in the expression levels of the growth-related genes TGF-β, cyclin D1 and Rb were also detected in V79-8-asCDK4 cells. CDK4 functions mainly in G1 and at the transition between G1 and S phases. Expression of an anti-sense CDK4 gene fragment reduces the levels of endogenous CDK4, CDK4/cyclinD kinase activity and the phosphorylation of Rb. These events may postpone the inactivation of the check-point leading to the delay of entry into S phase and the reappearance of G1 phase in V79-8-asCDK4 cells.