HCV RNA复制过程中5'UTR与3'UTR 作用的初步探讨

构建具有不同类型和长度的5'非编码区(UTR)及3'UTR的丙型肝炎病毒(HCV)全长cDNA克隆,体外转录制备RNA,转染肝癌细胞HepG2,研究不同RNA转录体在细胞内的复制情况。通过RT-PCR与Westernblot等方法证明:蛋白编码区来源于1a基因型并具有1b型5'UTR及3'UTR(全长或缺失98nt保守区)的2种嵌合型HCVRNA,都可以在病毒易感细胞中复制和表达;而以脑心肌炎病毒(EMCV)内核糖体进入位点(IRES)替代HCV5'UTR的嵌合型RNA转染细胞,检测不到病毒正、负链RNA与蛋白表达。以上结果说明HCV1b型5'UTR与3'UTR可以支持1a型病毒RNA的正常复制,3'UTR保守区的存在与否,对病毒复制影响不大。     

EGCG棕榈酸酯体外抗HCV作用的研究

为探讨表没食子儿茶素没食子酸棕榈酸酯(EGCG-P)抗丙型肝炎病毒(HCV)的作用,本研究采用cck-8法检测EGCG-P对Huh7.5.1细胞系的毒性作用,丙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒检测HCV滴度,通过实时荧光定量PCR(RT-PCR)选择合适的病毒感染复数(MOI),进而研究药物抗病毒的作用效果。结果:EGCG-P浓度为0~50mg/L时对Huh7.5.1细胞无毒害作用,且抗病毒作用显著;当其浓度为25mg/L时病毒表达量为阳性对照的1/6,可见EGCG-P能高效抑制HCV的增殖。     

用体外转录法制备小干扰RNA抑制Hela细胞CUEDC2基因表达

CUEDC2是一个广泛表达于各种真核生物、功能尚不明确的基因.利用一种改进的体外转录方法获得包含CUEDC2基因靶序列的长链RNA,进而通过RNA酶H切割引导序列形成成熟siRNA.转染Hela细胞并进行免疫印迹检测.结果显示,运用此方法得到的siRNA能够有效地抑制细胞中内源CUEDC2的表达,此项方法为CUEDC2的深入功能分析奠定了基础.     

小儿扁桃体淋巴细胞Poly（A）—RNA的制备及其cDNA的合成

采用盐酸胍法从经PHA诱导的小儿扁桃体淋巴细胞中提取总RNA,经Oligo(dT)-纤维素柱层析制备了Poly(A)-RNA。经蔗糖线性密度梯度超速离心步骤,富集了含IL-2mRNA的Poly(A)-RNA。经麦胚无细胞体系翻译实验表明,富集后的Poly(A)-RNA具有良好的模板翻译活性,其~3H-亮氨酸参入活性是对照的5.1倍。又以此富集了的Poly(A)-RNA为模板,按照Watson和Jackson的最新方法合成了小儿扁桃体淋巴细胞的双链cDNA。经碱性凝胶电泳检查,用此方法合成的cDNA长度最长的超过了IL-2的cDNA长度。     

葡激酶突变体Y1-Sak的体外变复性研究

具有低免疫原性的双功能葡激酶突变体Y1-Sak(△15,S16K,K74A,E75A,R77A,K109R,F111D)在大肠杆菌中的表达产物为包涵体,必须进行体外变复性才能得到活性.详细研究了复性方式、pH、温度、复性的初始蛋白浓度和添加L-精氨酸对Y1-Sak的体外变复性的影响,发现复性温度和添加的L-精氨酸对Y1-Sak的复性有重要的影响.经过工艺优化后,Y1-Sak的纯化活性回收率达到40%左右,蛋白比活性由20 kU/mg提高到53 kU/mg.用动态光散射分析发现,工艺优化后复性的高比活性Y1-Sak的水合动力学半径与野生型葡激酶相近,分子基本处于单体状态.     

大肠杆菌碱性磷酸酶突变体的构建及其结构与功能研究

以大肠杆菌碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,AP)高活性突变株(L138PG233S)为亲本,采用重叠延伸PCR的方法进行定点突变,成功获得了氨基酸替换突变体3个,并对它们的酶活性、特性、内源荧光发射峰等与亲本酶进行了比较分析.结果发现:与亲本酶相比,突变体酶的酶活性降低了18%～85%,Vmax值降低,Km增加,内源荧光发射峰λmax增大等.与亲本酶相同,Zn2 ,Mn2 ,Mg2 仍是它们的激活剂,Na3PO4是它们的抑制剂;这些实验结果说明突变体酶活性的降低直接与其构象变化有关,被替换的氨基酸在维持碱性磷酸酶的结构和功能方面具有特定的作用.     

香雪兰花瓣总RNA的提取和cDNA文库的构建

以不同开放时间的红色香雪兰的花瓣为材料,利用CTAB裂解、LiCl沉淀的方法提取出高质量的总RNA,经纯化mRNA后,合成双链cDNA,加上EcoRⅠ和XhoⅠ接头,用胶回收的方法将500 bp以上的cDNA回收并连在载体上,获得了重组率为89%,滴度为4.8×105pfu/mL的香雪兰花瓣质粒cDNA文库,为研究香雪兰花香和花色的相关基因奠定了基础.     

红豆杉细胞培养生产紫杉醇粗品制备紫杉醇原料药的研究

通过考察紫杉醇提纯的多种方法,优化结晶析出法和柱层析法的工艺参数,首次将红豆杉细胞培养生产的65%的紫杉醇粗品分离纯化为符合美国药典USP标准的紫杉醇原料药.以红豆杉细胞培养生产的65%的紫杉醇粗品为原料提纯制备紫杉醇原料药的方法,重复性好、工艺合理、操作简单、绿色安全,有望解决紫杉醇原料药的药源供应严重不足的问题.     

模板甲基化水平对鼠肝RNA聚合酶体外转录活性的影响

利用３Ｈ－ＵＴＰ同位素参入法，研究了大鼠肝细胞ＲＮＡ聚合酶在核内外的转录活性，结果表明：在细胞核内的转录活性明显低于在无核抽提物中的转录活性。利用自身的ＤＮＡ模板，优于利用外加的ＤＮＡ模板。并比较了不同ＤＮＡ甲基化水平的模板对ＲＮＡ聚合酶体外转录活性的影响，发现模板的甲基化水平与其体外转录水平呈反相关。     

一种改进的小非编码RNA cDNA文库构建方法

本文使用RNA Antisense Purification(RAP)技术富集纯化sncRNA,有效去除了5S、5.8SrRNA.联合使用Tobacco Acid Pyrophosphatase(TAP)和RNA 5′Polyphosphatase处理sncRNA,将5′-端为非单磷酸结构的sncRNA转变成单磷酸结构,增加了文库覆盖率.在sncRNA3′-端添加poly(A)尾结构以及使用oligo(dT)16VN-adapter锚定引物进行逆转录,间接解决了sncRNA 3′-端接头定向连接问题,不再使用价格昂贵的腺苷化接头.改进后的sncRNA cDNA文库容量为3×105cfu,重组率为95%,且测序结果显示,获得的cDNA序列具有较好的完整性.使用这种成本低且行之有效的改进方法,为深入研究sncRNA奠定了基础.     

地高辛掺入法检测HCV RNA含量在肝病诊断中的应用

目的：研究血清HCVRNA含量与HCV感染者肝病程度的关系。方法：应用地高辛掺入法检测血清HCVRNA含量。在PCR过程中将DIG－dUTP掺入到PCR产物中去，再用PCRELISA法检测PCR产物，结合标准参考样本而达定量目的。结果：丙肝后肝硬化组血清HCVRNA含量显著高于丙型肝炎组。结论：地高辛掺入法检测血清HCVRNA含量可以为HCV感染者的病情判断提供科学依据。     

传染性法氏囊病病毒在鸡胚细胞上的优化繁殖

研究了传染性法氏囊病病毒在鸡胚细胞上繁殖上的优化条件，结果表明，鸡胚细胞体外增殖培养后对ＩＢＤＶ的敏感性并不减弱，而且有提高。维持培养基中血清浓度的变化对病毒的繁殖影响不大。     

Specific immune responses induced by a multi-epitope antigen of hepatitis C virus in mice and rabbits

Five highly conserved and immunogenic epitopes of hepatitis C virus (HCV) have been chosen to form a multi-epitope antigen gene and fused with β-galactosidase gene to express a hybrid GZ-PCX antigen, which could be specifically recognized by human HCV sera. High level of anti-GZ-PCX IgG has been induced when mice or rabbits were immunized with GZ-PCX antigen emulsificated with complete Freund’s adjuvant or mixed with killed attenuatedSalmonella typhimurium SL3261. The specific anti-GZ-PCX IgG reached a high titer of 10^-6, which remained for several months. Specific cytotoxic T lymphocyte (CTL) effects, delayed type hypersensitivity reaction (DTH) and proliferation of peripheral lymphocytes have been induced by GZ-PCX antigen or synthetic peptides. High level of anti-GZ-PCX slgG has been detected in mice’s intestinal washing fluids, which indicates that the antigen induced mucosal immunity as well as systematic immunity. The studies show that the HCV multi-epitope antigen induces high level of specific immune responses without obvious toxicity, which might be able to provide protectivity to any HCV genotypes and isolates.     

截短型HCV NS5B RNA聚合酶在大肠杆菌中表达纯化及鉴定

为构建HCV截短型ns5bΔ21基因的原核表达质粒;在大肠杆菌中表达NS5B蛋白并纯化,制备其抗体。运用软件设计引物,以BB7复制子为模板PCR扩增ns5bΔ21基因;克隆入原核表达载体pRSETA。将重组表达质粒pRSETA-ns5bΔ21转化BL21大肠杆菌,并诱导表达、可溶性分析及纯化;用纯化的NS5B蛋白免疫小鼠制备多克隆抗体。结果酶切鉴定和序列测定表明成功的构建了重组表达质粒pRSETA-ns5bΔ21;其经IPTG诱导后行SDS-PAGE可见新生表达条带,Western-blot证实了其特异性和抗原性良好;利用镍离子亲和层析和电洗脱方法获得了纯化NS5B蛋白;用纯化蛋白免疫小鼠制备出了多价抗血清。说明表达和纯化的截短型HCV NS5B RNA聚合酶可用于下一步筛选单链抗体。     

分支DNA探针法检测21例丙型肝炎血清病毒RNA

目前主要依赖检测丙型肝炎抗体来确定对丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus,HCV)感染的诊断,但它不能反应机体是否有活动的病毒血症。分支DNA探针法应用合成的DNA分子与靶HCV—RNA特异性的杂交,形成RNA—DNA杂交体,用dioxetane作为底物与化学发光物结合,通过测定其发光强度可直接检测血清HCV—RNA的含量。本文测定21例慢性活动性丙型肝炎血清。HCV—RNA最低值为0.66Meg/ml;最高值为58Meg/ml,21例中86％的数值分布在0.66Meg/m-12Meg/ml的范围内。此方法cutoff值为0.5Meg//ml。我们所测定的21例均高于cutoff值。此方法操作简便,特异性强。为临床丙型肝炎治疗的监测及疗效的判断提供了重要的依据。     

丙型肝炎病毒NS3基因真核质粒的构建及其在人肝细胞中的诱导表达

目的：进行丙型肝炎病毒非结构蛋白3基因真核表达载体的构建,并分析其在体外培养的人肝细胞中的表达。方法：从含有丙肝病毒全长基因的重组质粒pBRTM／HCV1-3011表达载体中PCR扩增出HCVNS3基因片段,将其与表达载体pcDNA3．1（-）重组,得到重组的真核表达载体pcDNA3．1（-）／NS3。然后采用阳离子多聚体将其转染人肝细胞QSG7701,以免疫组织化学SP法及Western Blotting检测HCVNS3蛋白的表达。结果：所得到的NS3片段正确,序列正确,所构建的真核质粒成功转染QSG7701细胞并表达蛋白,表达的NS3蛋白相对分子质量为70000。结论：成功构建了丙型肝炎病毒非结构蛋白3基因的真核表达载体pcDNA3．1（-）／NS3,并且该载体在体外培养的人肝细胞中能有效表达特异性HCVNS3蛋白。     

HCV基因分型在丙肝诊断和治疗中的应用

目的 建立ＨＣＶ基因分型方法，研究ＨＣＶ基因型与肝病程度的关系，探讨ＨＣＶ基因型与ＩＦＮ－ａ２ｂ抗病毒疗效的关系。方法 ＨＣＶ基因组ＮＳ５区ＰＣＲ扩增产物酶切分型。结果 ７３例ＨＣＶ感染者中有ＨＣＶⅡ型４５例，ＨＣＶⅢ型２８例。Ⅱ型ＨＣＶ感性肝炎３１例，肝硬化１４例；Ⅲ型ＨＣＶ感染者中有慢性肝炎２６例，肝硬化２例。Ⅱ型ＨＣＶ感染者的肝硬化发生率显著高于Ⅲ型ＨＣＶ感染者（Ｐ〈０．０５）。所有病人均应     

体外诱导骨肉瘤特异性抗肿瘤的免疫实验

采用分离骨肉瘤患者外周血单核细胞体外诱导DC细胞,Trizol法提取患者骨肉瘤细胞总RNA,用总RNA转染DC并诱导特异性CTL的扩增,用MTT法检测淋巴细胞的增殖和CTL的杀伤活性。探讨骨肉瘤细胞总RNA转染的DC疫苗体外诱导特异性抗肿瘤免疫的能力。经骨肉瘤细胞总RNA转染的DC特异性表面标志及功能相关分子表达均上调,转染后的DC可显著刺激自体T淋巴细胞增殖,诱导的特异性CTL对靶细胞的杀伤率显著高于单纯淋巴细胞和未经转染的DC。说明骨肉瘤细胞总RNA转染的DC疫苗可在体外诱导出特异性抗肿瘤免疫。     

尤文肉瘤细胞总RNA转染的DC疫苗体外诱导尤文肉瘤患者特异性抗肿瘤免疫的实验研究

为了探讨尤文肉瘤细胞总RNA转染的DC疫苗体外诱导特异性抗肿瘤免疫的能力,采用分离尤文肉瘤患者外周血单核细胞体外诱导DC细胞,Trizol法提取患者尤文肉瘤细胞总RNA,用总RNA转染DC并诱导特异性CTL的扩增,用RT-PCR方法检测肿瘤总RNA加载的DC细胞的表达,用MTT法检测淋巴细胞的增殖和CTL的杀伤活性.结果RT-PCR测定显示尤文肉瘤细胞总RNA转染的DC细胞可以呈递肿瘤特异性抗原,并特异性地表达其特有序列EWS-FLI1.经尤文肉瘤细胞总RNA转染的DC特异性表面标志及功能相关分子表达均上调,转染后的DC可显著刺激自体T淋巴细胞增殖.诱导的特异性CTL对携带EWS-FLI1抗原的靶细胞的杀伤率显著高于LAK细胞和未经转染的DC.说明尤文肉瘤细胞总RNA转染的DC疫苗可在体外诱导出特异性抗肿瘤免疫.