重组BbFGF工程菌的发酵条件

利用大肠杆菌BL21（DE3）pLysS生产重组牛碱性成纤维细胞生长因子(BbFGF),对此工程菌的发酵条件进行了研究，在前期试验的基础上，重点探索培养基、诱导剂及区葡萄糖添加方式对T7启动子指导下的bFGF合成的影响，根据摇瓶试验和分批发酵试验结果，建立了一套变速加葡萄糖的高密度补料分批发酵工艺，在此工艺下，经11h发酵，可得光密度为30.7、bFGF产量为95mg/L的发酵产物，两步法纯化目的蛋白，得到纯度为95%的重组bFGF，其生物活性和标准品一致。     

高密度培养大肠杆菌表达人角质细胞生长因子

角质细胞生长因子(KGF)是成纤维生长因子家族(FGF)成员,与上皮细胞增殖、组织胚胎发育、创伤修复等过程密切相关.在大肠杆菌BL21(DE3)中克隆KGF基因,并进行诱导表达条件的优化.使用合成培养基,应用底物反馈流加策略将糖浓度控制在较低水平,在发酵罐中高密度培养,细胞干质量浓度可以达到46 g/L.发酵罐培养的大肠杆菌在对数生长期经过异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导,在可溶性和不溶性产物中都得到了具有免疫学活性的GST-KGF融合蛋白,经过ELISA检测,发酵液中可溶性表达的KGF产率达到108μg/L.该研究为利用原核表达系统生产活性KGF建立了优化工艺,有利于将大规模生产用于创伤修复的KGF.     

TIR突变的hbFGF在原核系统中高效的表达

目的：为获得非融合高表达hbFGF的大肠杆菌表达系统；方法：设计PCR引物，将hbFGF的5’端前10个密码子突变，优选大肠杆菌较偏好的密码子并降低G C含量，通过双酶切法将突变后的hbFGF克隆人pBV220质粒载体中，筛选出重组子，再通过温控法对重组菌体进行诱导，分析表达情况，并进一步纯化和测活；结果：bFGF在该系统中高水平表达，表达量超过30％，其中绝大部分形成包涵体，经过包涵体变复性等纯化步骤后测活性，证明有生物活性；结论：TIR区域的基因突变对hbFGF在pBV220中高效表达起到关键作用。     

bFGF在原代培养人皮肤成纤维细胞中的高效分泌表达

目的：提高碱性成纤维细胞生长因子在原代培养的成纤维细胞中的分泌表达。方法：bFGF缺乏典型的分泌信号肽,将鼠抗体轻链基因Igx的信号肽序列引入该基因的5′端得到新的IgK-bFGF重组体基因。同时考虑到人源细胞氨基酸编码密码子的偏好性,对整个基因序列密码子的第3位摇摆碱基作了偏好性调整,并克隆入真核表达载体中。得到的重组质粒用酶切的方法线性化,尽量去除质粒载体上大肠杆菌起源的基因序列,然后通过电穿孔的方法将线性质粒转导入原代培养的人皮肤成纤维细胞。结果：与野生型的bFGF基因相比,嵌合体bFGF被大量分泌到培养基中,同时对于成纤维细胞的增殖有明显的促进作用。结论：这种嵌合体基因的构建可以明显提高成纤维细胞对bFGF。的分泌表达。     

流加培养重组大肠杆菌表达核糖核酸酶Ba

核糖核酸酶Ba(barnase)是一种产自解淀粉芽孢杆菌的胞外核糖核酸酶,具有强毒性,能降解RNA,在农业、医疗、制药等领域有广泛的应用前景.利用重组表达barnase的大肠杆菌为研究对象,以期使用kil基因改善分泌状况,并实现大肠杆菌的高密度培养以及蛋白的高产表达.通过把kil-Km分泌盒克隆入质粒载体pET-32a(+)-barnase-barstar使barnase更加容易分泌与纯化,并使用Riesenberg培养基对重组大肠杆菌发酵生产barnase的不同葡萄糖浓度底物反馈控制补料流加策略进行了研究.初步确定1.0 g/L葡萄糖底物反馈流加时,获得的barnase酶活最高,为7.14 kU/mL,是文献报道的1.88倍,此时细胞干质量浓度为22.93 g/L,其中细胞间质的酶活达到3.53 kU/mL.为今后的发酵bar-nase研究提供了参考.     

重组人碱性成纤维细胞生长因子的纯化及生物活性鉴定

目的 :探讨重组人碱性成纤维细胞生长因子 (rhbFGF)的纯化工艺和活性鉴定 .方法 :将rhbFGF工程菌大量扩增后通过包涵体提取、复性、阳离子交换、凝胶过滤等技术进行纯化 .结果 :纯化后的rhbFGF ,相对分子质量为 17× 10 3,蛋白纯度为 95 %以上 ,比活为 1 7× 10 6 U/mg ,对NIH3T3细胞具有明显的促分裂活性 .结论 :通过复性和两步层析的纯化方法可获得高纯度、高回收率和高生物活性的rhbFGF ,可用于实验室研究及临床试验     

大鼠胎脑神经干细胞的分离和培养

胚龄14．5～16．5d(E14．5～16．5)的大鼠胎脑组织获得大鼠胎脑神经干细胞(rat fetal neural stem cells，rFNSCs)，培养于含有碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)和表皮生长因子(epidermal growth factor，EGF)的无血清培养液DMEM／F12中，用^3[H]胸苷掺入试验检测EGF和bFGF对大鼠胚胎神经干细胞分裂和增殖的影响．BrdU结合反应和nestin免疫组化检测显示培养细胞在早期时代约90％以上具有分裂增殖能力并显示nestln阳性，而且这些细胞在培养过程中可以分化神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞，证明分离培养的是神经干细胞，可用于移植、定向分化和基因转移的研究．     

重组大肠杆菌生产rhG-CSF发酵工艺的研究

在5L发酵罐中，研究了溶解氧(DO)、诱导时机、接种量等因素对重组大肠杆菌DH5α／pBV220生产rhG-CSF的影响．结果表明，在ω(D0)≥50％，茵体光密度D600≈4．50，42℃诱导表达4h的条件下rhG-CSF的茵体干重可达6．61g／L，表达量为38．1％．     

大肠杆菌BL21(DE3)氨基葡萄糖代谢调控相关基因的敲除及glmS在其中的表达研究

氨基葡萄糖(Glucosamine,GleN)是一类广泛使用的保健品,对于人类软骨再生及关节炎的临床治疗都具有良好的疗效.为构建以代谢工程为基础的氨基葡萄糖生产菌株,采用λRed同源重组系统将大肠杆菌BL21(DE3)中甘露糖-磷酸转移酶系统操纵子(manXYZ)和乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)转运和代谢特异性系统操纵子(nagBACD-nagE)进行双剔除.随后构建含新型氨基葡萄糖合成酶基因(glmS)的表达载体pETG,并将它转化该双操纵子剔除菌株.结果表明,改造后的菌株不能以GleN或GlcNAc作为碳源进行代谢生长.表达GlmS菌株的上清液经Ni-NTA亲和层析纯化,其酶活性达8.63 U/mg,表明该菌株已具备发酵生产GleN的初步特性.     

碱性成纤维细胞生长因子对无血清培养大鼠生长板软骨细胞的影响

目的：探讨碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）用于无血清培养扩增软骨细胞的可行性及最适质量浓度。方法：分离、培养大鼠肋生长板软骨细胞（rat costochondral growth plate chondrocyte,RGC）。细胞化学和免疫细胞化学染色的方法检测第1代RGC中蛋白多糖和Ⅱ型胶原的表达。观察0．1、1．0、10．0和100．0μg/L bFGF对无血清培养RGC形态的影响,并分别用^3H—TdR和^3H—Proline掺入法检测上述质量浓度bFGF对无血清培养RGC增殖和胶原合成的影响。结果：第1代RGC表达蛋白多糖和Ⅱ型胶原,保持了软骨细胞的分化表型。随着bFGF质量浓度的增加RGC的形态由多角形变为梭形和圆形。与无血清对照组相比,上述4个质量浓度的bFGF均显著促进RGC的增殖和胶原合成（P〈0．05）,其中1．0和10．0μg／L bFGF促RGC增殖的作用与10％胎牛血清（FBS）对照组差异无显著性意义（P〉0．05）,但促胶原合成作用较弱,相当于10％FBS对照组的印％左右（P〈0．05）。结论：bFGF可用于无血清扩增软骨细胞,1．0～10．0μg/L是适宜的质量浓度范围,但其促胶原合成作用较弱,还需添加其他因子以弥补促胶原合成作用的不足。     

重组人碱性成纤维细胞生长因子诱导Balb/c3T3细胞增殖的实验研究

目的研究不同浓度重组人碱性成纤维细胞因子对Balb/c 3T3细胞增殖活性的影响.方法重组质粒pGEX-bFGF转入到DH5α大肠杆菌体内,增菌培养表达bFGF,亲和层析纯化,制备8种不同药物浓度的bFGF,分别进行诱导Balb/c 3T3细胞增殖实验研究,MTT法检测各组细胞增殖活性.结果 bFGF诱导Balb/c 3T3细胞增殖存在浓度依赖性,最适浓度为4～16μg/L.结论 bFGF具有较好的诱导Balb/c 3T3细胞增殖的能力,为后续研究工作奠定实验基础.     

枯草杆菌纳豆激酶基因的克隆及其在E.coli BL21(DE3)plysS中的表达

用CTAB法从枯草杆菌(纳豆株)中提取基因组DNA,聚合酶链式反应(PCR)扩增获得837bp的DNA片段,将该基因片断克隆到pMD18-T载体上,筛选重组子,通过限制性内切酶、PCR技术和测序分析确定该重组子所含插入片断为纳豆激酶基因．利用基因重组技术构建了纳豆激酶基因的融合表达载体,转化E．coli BL21(DE3)plysS后经IPTG诱导在大肠杆菌中高效表达,经SDS—PAGE电泳及bandscan软件分析融合蛋白分子量约为33．4kD,约占菌体总蛋白29．4％．     

人碱性成纤维细胞生长因子在大肠杆菌中的融合表达

将人碱性成纤维细胞生长因子ｈｂＦＧＦ基因克隆于质粒ｐＧＥＸ，构建了融合蛋白ＧＳＴ－ＦＧＦ的表达质粒ｐＧＥＸ－ＦＧＦ，将ｐＧＥＸ－ＦＧＦ转化大肠杆菌ＤＨ５α，诱导培养后测得融合蛋白表达量占菌体总蛋白量的２２％，每升发酵液中可产生１８８ｍｇ ＧＳＴ－ＦＧＦ。     

重组拖丝蛋白基因在大肠杆菌中表达条件的优化

对巳构建的重组蜘蛛拖丝蛋白基因表达菌株pNS2，以IPTG为诱导剂，建立最适表达条件．在LB培养基中添加质量分数为0．1％的甘氨酸和丙氨酸，菌体培养至密度A600＝0.5—0．7时加入浓度为0．2mmol/L的IPTG，诱导5h，可得到表达量占可溶性总蛋白质27．2％的较好结果．     

大鼠局灶性脑缺血再灌注碱性成纤维细胞生长因子蛋白表达的研究

目的 检测大鼠局灶性脑缺血再灌注后中心区、半影区bFGF的蛋白表达动态变化及意义。方法 采用线检法制作大鼠局灶性脑缺血再灌注模型，采用神经病学评分，TTC染色，光镜检测对模型予以评价，并用免疫组化法观察缺血3h再灌注3，6，24，72h缺血中心区、半影区bFGF表达的动态变化，并观察相应时间点、相应区域病理组织学变化．结果 在正常组及假手术组bFGF呈弱阳性表达．缺血3h及缺血3h再灌注3，6h中心区、半影区表达明显增强．与假手术组比较，差异显著(P＜0、05)、缺血3h再灌注24，72h缺血中心区bFGF表达下降，但仍较正常对照组高，此时半影区表达呈持续升高趋势，24h达高峰，72h有所下降。而相应病理变化为：缺血3h可见轻重不等的神经细胞变性坏死，缺血3h再灌注中心区及半影区随缺血再灌注时间延长，病理组织学变化逐渐加重．结论 正常脑组织中bFGF呈弱阳性表达，缺血中心区及半影区随缺血再灌注2d内随时间延长表达增强，与神经细胞缺血改变加重呈正相关．提示bFGF对脑缺血损伤后的神经细胞有保护和修复作用。     

葡萄糖供应速率对大肠杆菌表达及分泌人表皮生长因子的影响

采用一株大肠杆菌BL 21(DE 3)[pBLMVL 2EGF]生产人表皮生长因子(hEGF),其中hEGF表达由PL启动子控制并通过phoA信号肽分泌到胞外。实验结果表明:诱导阶段以恒定比供应速率流加葡萄糖时,流加速率对hEGF的表达和分泌有很大影响。当葡萄糖比供应速率为0.122g/(g.h)时,hEGF表达水平最低,分泌效率最差,只有37.5%;随着葡萄糖比供应速率的增加,胞外和胞内hEGF比生产速率明显增加,当葡萄糖比供应速率为0.196 g/(g.h)时,单位菌体产生的hEGF水平最高(121.6 m g/g),其中分泌至胞外的hEGF占42%。此外,诱导前补充有机氮源有利于提高诱导初始hEGF的生产速率。     

重组工程菌E.coli BL21(DE3)-pET29a-aiiA可溶性AiiA蛋白的发酵条件优化

通过对工程菌E.coli BL21(DE3)-pET29a-aiiA的摇瓶发酵培养条件进行优化,确定了AiiA蛋白可溶性表达的最佳发酵培养基为牛肉膏蛋白胨.目的蛋白可溶性表达的最佳诱导条件为:IPTG浓度0.6 mmol/L,诱导初始OD600为0.5,诱导时间为20 h,温度20℃,pH为7.0,微量元素Na2HPO420 mmol/L,250 mL三角瓶的装液量为70 mL.优化前可溶性AiiA蛋白的相对含量为2.23 mg/mL,占总目的蛋白的31.4%,优化后达到4.54 mg/mL,占总目的蛋白的60.3%,大大提高了目的蛋白的可溶性表达.     

Production of Poly （3—Hydroxybutyrate—co—3—Hydroxyhexanoate） by Aeromonas hydrophila and Recombinant Escherichia coli

Aeromonas hydrophila (A. hydrophila) 4AK4 produced poly (3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyhexanoate) (PHBHHx) with an almost constant 3-hydroxyhexanoate (3HHx) content of 10 % - 15 % from lauric acid and/or soybean oil. Both A. hydrophila 4AK4 and recombinant Escherichia coil (E. coil) JMU193(pBH32) produced PHBHHx with controllable 3HHx content when fed lauric acid and another co-substrate. With glucose or gluconate as the co-substrate, the 3HHx content in the copolyester produced by A. hydrophila 4AK4 was reduced slightly from 12% to 9%. However, the 3HHx content in the copolyester produced by E. coll JMU193 (pBH32) was significantly reduced from 9% to 2% with fructose as the co-substrate. These results show that regulation of 3HHx content in PHBHHx can be achieved using genetically engineered E. coll.