外源脑啡肽基因在哺乳动物体细胞的表达

评价转染脑啡肽基因体细胞用于爱滋病和晚期癌症患者生物镇痛的可行性。方法：采用磷酸钙共沉淀法和脂质体包裹法，分别将ｈｅｎｋ基因或ｈｅｎｋ与ｎｅｏ基因导入三种哺乳动物体细胞，观察转染效率并用放射免疫法测定转染后ｈｅｎｋ基因的瞬时表达及稳定表达水平。结果：双基因共转染加Ｇ４１８筛选组的ｈｅｎｋ基因稳定表达水平（１００～２００ｐｇ／ｍＬ）明显高于单基因转染未经筛选组（６０～１００ｐｇ／ｍＬ）；脂质体包裹法在基因转染率（１３３％～１６１％）及表达水平（１５０～２４０ｐｇ／ｍＬ）方面均优于磷酸钙共沉淀法（２０％～２６％和１００～２００ｐｇ／ｍＬ），两者的稳定表达水平与ＰＣ－１２细胞的分泌水平（１６０ｐｇ／ｍｌ）相当，均能满足细胞镇痛的要求。结论：转脑啡肽基因体细胞的脑啡肽分泌量（１０７个细胞）可以满足镇痛的要求。若用于ＡＩＤＳ患者，可望长时间地缓解全身疼痛，并增强机体免疫功能和改善神经退行性痴呆症状     

哺乳动物细胞高效表达系统研究进展

哺乳动物细胞高效表达系统是生物制药工业中十分关键的环节,而表达载体和宿主细胞又是哺乳动物细胞表达系统的两个重要组成部分.文章较详细综述了通过目的基因整合位点的优化、增加目的基因拷贝数、提高目的基因的转录和翻译水平等构建哺乳动物细胞高效表达载体的研究进展.同时,为使宿主细胞更好地适应工业化大规模培养要求,对通过抗凋亡、细胞周期调控、糖基化、细胞增殖控制技术和多基因代谢等细胞代谢工程对其进行改造的研究进展也作了介绍.     

RNAi表达载体在哺乳动物中的研究进展

对RNA干扰(RNAi)表达载体的非生物与生物递送系统及主流应用进行综述,明确其在基因调控及未来基因治疗领域的应用前景,并指出其在种属特异性及表达效率等方面存在的局限性.对RNAi表达载体的结构组成、发展沿革及体内作用机制进行归纳分析,提出基于结构组成和加工机制双重属性的分类方法.     

病毒载体疫苗研究进展

从非复制性病毒（家禽痘、野鸟痘、痘苗和人类腺病毒）载体重组活疫苗、腺病毒载体重组口服活疫苗和杆状病毒载体重组亚单位疫苗三方面，评述了以病毒为表达载体的基因工程疫苗近年研究取得的重大进展。     

慢病毒及其载体系统研究进展

基于慢病毒的病毒载体的研究已经发展到一定水平,因此用慢病毒作为基因转移媒介的临床研究已经开始,在实验室和临床应用中,慢病毒具有特别的优点,尤其是能整合未分裂细胞的独特能力.现在基于HIV的慢病毒载体的临床研究已经开始应用于人体.本文介绍基于HIV-1的慢病毒和慢病毒载体的结构,慢病毒载体的优点以及慢病毒载体应用的展望.     

基因治疗中病毒载体的研究进展

目的:在基因治疗作为一种全新的疾病治疗手段得到了迅速发展的同时,探讨病毒载体在基因治疗中的应用。方法:通过对各种病毒载体的改造和完善,扩大其载体容量,提高基因的转染效率和克服体内的免疫反应等手段,可使病毒载体的应用更加符合临床的需要。结果:改造过的病毒载体大大提高了载体靶向的特异性和应用范围。结论:病毒以其独特的生物学特性作为基因治疗载体有着独特优势,在临床上得到了广泛应用。     

慢病毒载体研究进展

慢病毒作为一种特殊的逆转录病毒,与通常使用的逆转录病毒载体和腺病毒载体比较,具有可感染分裂细胞及非分裂细胞、转移基因片段容量较大、目的基因表达时间长、不易诱发宿主免疫反应等优点,已成为当前基因治疗和转基因动物中载体研究的热点。近年来对其基础生物学特性、载体改造及其应用等研究均取得了较大进展。本文就慢病毒载体及应用方面的研究进展作一综述。     

重组慢病毒对不同哺乳动物细胞基因转移及表达效率的研究

慢病毒是一种具有独特优点和巨大应用潜力的哺乳动物细胞基因转移载体,我们对慢病毒载体对不同哺乳动物细胞的基因转移及表达效率进行了平行比较研究.应用第三代重组慢病毒系统构建了携带CMV启动子-EGFP报告基因表达元件的重组慢病毒Lenti-EGFP,分别对多种不同哺乳动物细胞进行转导实验,在转导48 h后应用流式细胞仪检测报告基因在不同细胞株中的转移及表达效率.我们共使用了29种哺乳动物细胞株,包括14种人类组织细胞,5种猴组织细胞,9种鼠组织细胞,1种兔组织细胞.结果显示,重组慢病毒具有良好的基因转移能力,可有效进入多数哺乳动物细胞,对不同种属来源的细胞没有表现出特别的偏嗜性,但对贴壁培养细胞的基因转移效率明显高于对悬浮培养细胞.本研究为重组慢病毒系统的合理使用提供了基础.     

电穿孔法基因转染哺乳动物细胞的应用

应用电穿孔技术转染pEGFP于哺乳动物细胞，讨论了电穿孔技术的应用条件，影响因素，初步确定了COS7、Hela、HepG2、K562、Jurkat等细胞系的转染条件，为今后的分子生物学研究打下了良好的基础。     

哺乳动物核移植研究进展

核移植技术具有重大的生物学的意义，特别是体细胞核移植技术的成功表明动物分化的体细胞核可再程序化，哺乳动物核移植的研究虽然还存在许多问题需要解决，但在挽救濒危动物，转基因动物研究，人类器官移植等许多方面展现了广阔的应用前景．     

Npas4基因过表达慢病毒的构建及其在SK-N-SH细胞的表达

研究旨在构建Npas4基因过表达慢病毒,为进一步深入探索Npas4基因的功能奠定基础。用人工合成大鼠Npas4基因c DNA片段,将其插入p CDH-CMV-MCS-EF1-cop GFP构建慢病毒表达质粒p CDH-Npas4。酶切、测序验证质粒后,将p CDHNpas4和辅助质粒共转染包装细胞293T,浓缩上清得病毒颗粒并测定病毒滴度。取病毒颗粒感染SK-N-SH细胞48 h,收集细胞采用Western blotting法检测Npas4蛋白的表达。p CDH-Npas4携载正确Npas4基因,将其包装293T细胞后能产生病毒。病毒滴度为1.05×109TU/m L。相比于转染GFP病毒对照组(GFP)和未转染对照组(control),Npas4重组慢病毒组(Npas4)的细胞Npas4蛋白表达显著增高。成功构建Npas4基因过表达的重组慢病毒载体p CDH-Npas4,并获得高效的重组慢病毒,能将外源Npas4基因导入SK-N-SH细胞,为进一步研究Npas4基因的相关功能奠定了基础。     

生物反应器微载体系统大规模培养草鱼细胞及病毒

采用微载体GT-2在细胞培养生物反应器中悬浮培养草鱼细胞和草鱼出血病病毒。合适的工艺条件为:温度26℃,pH6.8～7.2(生长期),7.2～7.4(接毒后),搅拌转速40 r/min,溶氧(DO)40%空气饱和度。GT-2是一种较适合于草鱼细胞贴壁生长的微载体。细胞密度可达7.4×10~6 Cells/mL,病毒滴度可达8.00。     

脑心肌炎病毒pCMV-HA-VP2表达载体的构建及在HEK293细胞中的表达

目的:构建脑心肌炎病毒(Encephalomyocarditis Virus,EMCV)衣壳蛋白VP2基因的真核表达载体pCMV-HA-VP2,并在HEK293细胞中表达.方法:提取EMCV的总RNA,RT-PCR扩增VP2基因,酶切后构建带HA标签的真核表达质粒pCMV-HA-VP2,运用脂质体介导法将其转染至HEK293细胞中,分别进行过表达检测、Westernblotting分析及IFA检测来验证VP2基因的转录及表达情况.结果:重组表达载体pCMV-HA-VP2构建成功,转染至HEK293细胞中,VP2蛋白和HA标签融合表达成功.结论:EMCV衣壳蛋白VP2基因的真核表达载体pCMV-HA-VP2在HEK293细胞中的成功表达,为EMCV衣壳蛋白的功能研究提供理想的实验材料,同时也为EMCV感染机制及其受体研究奠定基础.     

甜菜坏死黄脉病毒新疆分离物外壳蛋白基因的原核表达载体和植物表达载体的构建

将克隆入ｐＧＥＭ７ｚｆ（＋）的甜菜坏死黄脉病毒（ＢＮＹＶＶ）新疆分离物外壳蛋白（ＣＰ）基因的ｃＤＮＡ的ｐＧＥＢ３，用ＸｂａＩ切下，Ｋｌｅｎｏｗ补平，再用ＢａｍＨＩ切下ｃＤＮＡ片段。用ＮｄｅＩ切开原核表达载体ｐＪＷ２，用Ｋｌｅｎｏｗ补平，再用ＢａｍＨＩ切去小片段。将该ｃＤＮＡ与ｐＪＷ２大片段用Ｔ４连接酶连接，构建了ＢＮＹＶＶＣＰ基因的表达载体ｐＪＷＢ４，转化到大肠杆菌ＤＨ５α。经培养和高温诱导，ｐＪＷＢ４成功地表达出了ＢＮＹＶＶ的外壳蛋白。将ｐＧＥＢ３和ｐＢＩ１２１用Ｘｂａｌ和ＢａｍＨＩ酶切Ｔ４连接酶连接，构建了ＢＹＶＶＣＰ基因的植物表达载体，转化到ＤＨ５α，筛选出正向连结的阳性克隆ｐＢＩＢ３，转化入农杆菌ＬＢＡ４４０４（ｐＡＬ４４０４），经用ＰＣＲ扩增和γ３２Ｐ标记的探针杂交约证实为阳性克隆。往甜菜植株中转化工作正在进行中。     

基因治疗载体的研究进展

基因治疗已经开始用于肿瘤、癌症及各种遗传性疾病的治疗当中,临床效果已经开始显现,且应用前景广阔。基因治疗的关键是采用适宜的载体材料将外源基因传递至受体靶细胞中,本文总结了基因治疗中常用的病毒、非病毒载体,报道如下。     

人白血病抑制因子真核表达载体的构建及在哺乳动物细胞中的表达

应用RT-PCR方法从人子宫内膜组织总RNA扩增出hLIF的全长基因,然后将其克隆至pcDNA3上,成功构建了重组真核表达载体pcDNA3/hLIF.利用脂质体介导将这一表达载体导入COS-7细胞和CHO-K1细胞,分别获得了hLIF的瞬时表达和稳定表达,为进一步进行hLIF生物学功能研究和hLIF在哺乳动物细胞中的高表达研究奠定了基础.     

病毒载体滴度对基因转移效率的影响研究

用改良的经典方法测定包装ＬａｃＺ基因的腺病毒和逆转录病毒载体的病毒滴度，以及用新建的简便方法测定逆转录病毒载体的病毒滴度，应用此两种病毒载体介导ＬａｃＸＺ基因分别导入１５种人或小鼠靶细胞，并以不同滴度的病毒上清液转染靶细胞Ｋ５６２，探讨病毒滴度对基因转移效率的影响，实验结果表明，病毒滴度与转染效率呈正相关，逆转录病毒滴度由１０＾６ＣＦＵ／ｍＬ。     

LITAF基因过表达慢病毒载体的构建及鉴定

目的：探讨构建人脂多糖诱导肿瘤坏死因子释放因子(LITAF)基因的过表达慢病毒载体的技术方法并检测其体外表达目的基因的水平。方法：设计LITAF基因引物,应用聚合酶链反应(PCR)的方法扩增LITAF基因片段,应用EcoRI、BamHI酶切LV8载体,通过连接酶将LITAF基因片段连接至线性化的LV8载体上,应用酶切及测序方法鉴定LITAF-LV8重组质粒。将其包装慢病毒后感染293T细胞(人胚肾细胞),观察绿色荧光蛋白(GFP)的表达,验证后感染肝癌细胞株HepG2。RT-PCR和Western-blot鉴定感染后HepG2中LITAF的表达。结果：LITAF基因在慢病毒感染的HepG2细胞中的表达显著高于对照组细胞。结论：成功构建了过表达LITAF的HepG2细胞株,为后期研究提供了实验基础。     

TBSV病毒瞬时表达载体构建及其表达

为了深入理解植物RNA病毒载体表达系统,初步建立了利用TBSV病毒表达载体在寄主植物烟草中表达外源蛋白的技术体系.以番茄丛矮病毒(Tomato bushy stunt virus,TBSV)为材料,构建了含报告基因sGFP的WY1,WY2等2个重组病毒表达载体,并将载体导入农杆菌GV3101用于侵染烟草植株叶片;利用农...