多个发夹RNA的混合使用抑制O型和AsiaⅠ型口蹄疫病毒的复制

通过对国内流行的口蹄疫病毒(FMDV)毒株的序列分析,锁定RNA干扰的3个目标基因即3D,VP4和2B,分别编码聚合酶POL,病毒结构蛋白VP4和非结构蛋白2B,这3个靶基因序列在不同流行毒株之间相对保守.分别设计合成靶向这些基因序列的发夹RNA(short-hairpin RNA,shRNA)表达模板,构建了5个shRNA表达质粒p3D-NT56,p3D-NT19,pVP4-NT65,pVP4-NT19和2B-NT25.进行单独应用或混合应用,于细胞水平和乳鼠水平检测其抗病毒活性.结果显示,3D-NT56/19,VP4-NT65/19和2B-NT25shRNA对O型FMDV均有抑制作用,但是对AsiaⅠ型FMDV,仅2B-NT25shRNA具有较显著的抑制作用.3个shRNA表达质粒(p3D-NT56 pVP4-NT65 p2B-NT25,p3D-NT19 pVP4-NT19 p2B-NT25)的混合使用,不仅能够交叉抑制不同血清型FMDV的复制,而且这种抑制作用较单一shRNA延续更长的时间.     

多个发夹RNA的混合使用抑制O型和AsiaⅠ型口蹄疫病毒的复制

通过对国内流行的口蹄疫病毒(FMDV)毒株的序列分析,锁定RNA干扰的3个目标基因即3D,VP4和2B, 分别编码聚合酶POL,病毒结构蛋白VP4和非结构蛋白2B,这3个靶基因序列在不同流行毒株之间相对保守.分别设计合成靶向这些基因序列的发夹RNA(short-hairpin RNA,shRNA)表达模板,构建了5个shRNA表达质粒p3D-NT56,p3D-NT19,pVP4-NT65,pVP4-NT19和p2B-NT25.进行单独应用或混合应用,于细胞水平和乳鼠水平检测其抗病毒活性.结果显示,3D-NT56/19,VP4-NT65/19和2B-NT25 shRNA对O型FMDV均有抑制作用,但是对AsiaⅠ型FMDV,仅2B-NT25 shRNA具有较显著的抑制作用.3个shRNA表达质粒的混合使用(p3D-NT56+pVP4-NT65+p2B-NT25,p3D-NT19+pVP4-NT19+p2B-NT25),不仅能够交叉抑制不同血清型FMDV的复制,而且这种抑制作用较单一shRNA延续更长的时间.     

O型口蹄疫病毒VP4蛋白一个保守性表位的精细鉴定

口蹄疫病毒(FMDV)的结构蛋白VP4在7个血清型之间是非常保守的,对其抗原表位最小基序的测定有助于开发广谱性多肽疫苗.本研究采用生物合成肽法,利用豚鼠抗FMDV O型标准血清,对最新流行的FMDV O型毒株O/BY/CHA/2010的VP4蛋白进行了线性表位扫描作图研究.结果表明:在覆盖VP4蛋白全长序列的10个18聚肽中,发现1个能与豚鼠抗FMDV O型标准血清发生免疫印迹反应的抗原性肽VP4-3;B细胞表位鉴定确定了抗体识别VP4-3的最小基序是INNYYM;该表位位于VP4蛋白的三维结构表面;对7个FMDV血清型的122个毒株同源蛋白质进行序列比对,发现这一表位在7个FMDV血清型的120个毒株中是100%保守.     

A型口蹄疫病毒VP1免疫活性肽基因串联片段的化学合成及克隆与表达

A型口蹄疫病毒（FMDV）VP1蛋白的141～160和200～213位氨基酸序列是决定FMDV免疫原性的抗原决定簇片断．人工合成一个免疫活性肽基因的串连片段（20AA－14AA-20AA）、全部选用大肠杆菌偏爱密码子．在5’端带有EcoR1位点和一个起始密码子ATG，在3’端带有BamH1位点和一个终止密码子TGA．利用这两个酶切位点把该基因连接到pWR590质粒上．并筛选高表达的菌株．结果表明该融合蛋白在大肠杆菌JM101中能高表达．经斑点ELISA实验证明．大肠杆菌细胞中表达的融合蛋白有A型FMDV抗原活性．     

抗口蹄疫病毒siRNA在HEK-293细胞诱导β-干扰素的研究

利用shRNA（shon-hairpinRNA）表达质粒在HEK-293细胞上评估了多个dsRNA诱发产生干扰素（IFN）的能力．结果显示,p3D3（19nt）,pPol（56nt）,p21NT（21nt）和p63NT（63nt）能够诱发IFN-β的产生,其中p3D3和p63NT能强烈诱导IFN-β;而p3D1（19nt）,p3D2（19nt）和pLacZ（83nt）没有明显的IFN-β诱发能力．结果显示,诱发干扰素产生的能力与dsRNA的片段长度没有关系,可能与其序列有一定相关性．     

Bcl-2 shRNA诱导成人T淋巴细胞白血病细胞株Molt4凋亡的研究

目的:探讨以Pgenesil-1质粒为载体表达的Bcl-2短发夹样RNA (short hairpin,shRNA)诱导Molt4成人T淋巴细胞白血病细胞株凋亡的作用.方法:采用脂质体介导的转染方法将表达Bcl-2 shRNA的两个RNA干扰质粒(Bcl-2 shRNA1和Bcl-2 shRNA2)、阴性组(针对非目的基因所构建的shRNA表达载体)、空白组及单纯脂质体组分别转染Molt4细胞.采用免疫细胞化学法检测转染48 h后的各组细胞Bcl-2蛋白表达水平;MTT法分别检测24,48,72 h各组细胞的增殖活性;用姬姆萨染色和流式细胞仪观察细胞凋亡情况.结果:转染Molt4细胞48 h后, Bcl-2 shRNA1组和Bcl-2 shRNA2组的细胞Bcl-2 蛋白表达率均明显下降;与阴性对照shRNA组、空白组和单纯脂质体组相比差异有显著性(P＜0.05), Bcl-2 shRNA1组的抑制作用要强于Bcl-2 shRNA2组.MTT测定显示Bcl-2 shRNA1组和Bcl-2 shRNA2组细胞增殖活力均明显下降,分别与空白组和单纯脂质体组进行比较差异有显著性(P＜0.05);阴性对照shRNA组与单纯脂质体组比较则无明显差异(P＞0.05).Bcl-2 shRNA1和Bcl-2 shRNA2作用于Molt4细胞48 h后,姬姆萨染色可见凋亡细胞.流式细胞仪检测示Bcl-2 shRNA1组和Bcl-2 shRNA2组细胞凋亡率随时间逐渐增高,与空白组和单纯脂质体组进行比较差异有显著性(P＜0.05),但Bcl-2 shRNA1组和Bcl-2 shRNA2组二者间无明显差异(P＞0.05).结论:Bcl-2 shRNA表达载体可促进Molt4细胞的凋亡.     

特异性siRNA对大鼠肝星状细胞TIMP-1表达的影响

观察金属蛋白酶组织抑制因子-1（TIMP-1）小干扰RNA真核表达载体转染肝星状细胞株HSC-T6后TIMP-1基因表达的情况。构建携带绿色荧光蛋白（GFP）基因的小干扰RNA真核表达载体pGCsi-U6／TIMP-1 shRNA,利用该载体介导四个特异性和一个非特异性的TIMP-1 shRNA,分别为TIMP-1 shRNA1、TIMP-1 shRNA2、TIMP-1 shRNA3、TIMP-1 shRNA4和TIMP-1 shRNA—NON。采用阳离子脂质体介导法转染HSC-T6细胞,激光共聚焦显微镜观察GFP表达,荧光实时定量PCR方法检测TIMP-1 mRNA表达情况。质粒转染HSC—T6细胞后,激光共聚焦显微镜观察转染组细胞内均见绿色荧光,未转染组未见绿色荧光;mRNA水平检测显示：与正常对照组相比,TIMP-1 shRNA1、TIMP—1 shRNA2和TIMP-1 shRNA4对TIMP-1基因表达较强的抑制作用,尤TIMP-1 shRNA1抑制作用最强（P〈0．01）。pGCsi—U6介导的TIMP-1 shRNA1能更加有效的抑制肝星状细胞中TIMP—1的表达。     

O型口蹄疫病毒VP1基因重组山羊痘病毒活载体疫苗的研究

旨在构建能够表达O型口蹄疫病毒(FMDV)VP1基因的重组山羊痘病毒(GPV),并以此为活载体疫苗,评估其免疫效力.将FMDV的VP1基因插入转移质粒pTKfpgigp中,构建重组转移质粒pTKfpgigp-VP1,并转染已感染GPV的羔羊睾丸(LT)细胞,产生重组GPV(rGPV),筛选纯化rGPV,检测rGPV在LT细胞中VP1基因的表达情况.将获得的rGPV皮内接种山羊,检测抗山羊痘(GP)和口蹄疫(FMD)特异性抗体水平.结果表明,获得含有FMDV的VP1基因重组毒株rGPV/FMDVVP1,在LT细胞中VP1基因进行正常转录,其表达产物能与FMDV抗血清产生特异性反应.rGPV能诱导产生不同水平的抗GP和FMD的特异性抗体.可为FMD重组标记疫苗的研制提供参考.     

PP2A B56α调节亚基原核表达载体的构建及表达

为了构建PP2A B56α调节亚基原核表达载体,以p CEP-4HA-B56α质粒为模板,设计引物克隆人源PP2A B56αc DNA,连入p GEX-4T-1载体中,测序正确后,转化E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达,并将诱导表达重组蛋白的菌体超声破碎后,进行可溶性分析,对可溶性蛋白进行纯化.SDS-PAGE电泳及Western Blot分析鉴定重组蛋白.结果表明,经测序和酶切鉴定后成功构建重组质粒p GEX-4T-1-B56α,表达大小约79 k D的重组蛋白,可溶性表达的重组蛋白为菌体总蛋白质量的8.6%,经GST纯化系统纯化得到纯度约为78.9%的重组蛋白,回收率达到52.2%.因此,本研究成功构建了PP2A B56α原核表达体系,获得重组蛋白,为研究PP2A B56α的生物学功能奠定了基础.     

抗A5型口蹄疫病毒重组多肽疫苗的研究

根据A型口蹄疫病毒（FMDV）的VP1基因序列及国际上公认的抗病毒中和表位,并结合对口蹄疫病毒的研究成果。设计了A型FMDV的重组多肽疫苗．分别选择VP1上21～40位和137～160位氨基酸对应的基因序列为表位基因,组成137～160—21～40-137～160的串连结构,并以大肠杆菌β-半乳糖苷酶为大分子载体,构建重组质粒pLM99,在大肠杆菌中表达得到高含量的融和蛋白．体外免疫原性检测表明,所表达的融和蛋白与标准A型阳性血清有特异性抗原／抗体反应,即说明该融和蛋白具有免疫反应性．免疫豚鼠的实验结果表明,融合蛋白能在豚鼠体内诱导中和抗体,并使70％的豚鼠能抵抗病毒的攻击．     

MS2介导的口蹄疫类病毒颗粒疫苗的研究

研究表明,口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus,FMDV)的VP1蛋白含有关键的抗原决定簇.根据O/HL-JOC12/03猪源FMDV毒株VP1上第141～160位氨基酸序列设计引物,利用重叠延伸PCR(SOE PCR)技术将该序列插入在大肠杆菌(Escherichia coli)噬菌体MS2外壳蛋白基因的特定位点.然后连接到原核表达载体pET28a上,构建了重组表达质粒28a-CP-VP1,转化BL21(DE3),ITPG诱导表达得到融合表达的CP-VP1.透射电子显微镜下观察融合蛋白CP-VP1成类病毒颗粒(virus-like particles,VLPs)状.间接ELISA实验证实该蛋白能够特异地结合豚鼠抗O型FM-DV的阳性血清,30μg的CP-VP1的VLPs蛋白免疫小鼠后可以诱导其产生高效价的特异抗体.故该口蹄疫病毒抗原决定簇展示在噬菌体MS2上表面的VLPs蛋白具有开发成口蹄疫疫苗的前景.     

猪繁殖和呼吸综合征病毒福建毒株ORF5的序列分析及原核表达

根据猪繁殖和呼吸综合征病毒(PRRSV)已发表的核苷酸序列,设计了一对特异性引物(p1/p2),用RT-PCR扩增PRRSV福建毒株FJ-1的全长糖基化囊膜蛋白基因(ORF5),将扩增产物连接到pUCm-T载体并转化大肠杆菌DH10B,筛选阳性重组质粒进行序列测定与分析.再设计另一条引物(p3)与p2从重组载体pUCm-T-ORF5中扩增出缺失了N端30个氨基酸残基的tGP5的编码序列tORF5,克隆入表达载体pGEX-4T-3后在大肠杆菌中表达.结果表明,FJ-1毒株ORF5基因为603 bp,编码200个氨基酸,与北美型参考毒株VR-2332、CH-1a及欧洲型参考毒株LV的氨基酸同源性分别为87%、89%和53%,推定福建毒株FJ-1属于北美型毒株.原核表达产物经过SDS-PAGE及Western Blot分析,证实为GP5与谷胱甘肽转移酶(GST)的融合蛋白.分子量为41 kDa.表达量约占菌体蛋白的15%,主要以包涵体形式存在.     

传染性法氏囊病病毒结构的分子生物学研究进展

传染性法氏囊病是一种严重危害雏鸡的免疫抑制性、高度接触性传染病.传染性法氏囊病病毒为双RNA病毒,有A、B两个片断.A片断编码4种蛋白VP2,VP3,VP4和VP5,B片断编码VP1蛋白.其中的VP2和VP3是主要的宿主保护性抗原,在病毒的结构、变异、毒力和免疫原性方面有着重要的作用.     

低表达长非编码RNA MALAT1对人宫颈癌HeLa细胞体外生长和迁移的影响

设计3个针对MALAT1不同靶序列的小干扰RNA(small interfering RNA, siRNA), 筛选出有效的siRNA序列, 设计并构建短发夹RNA(short hairpin RNA, shRNA)干扰质粒, 转染到HeLa细胞中, 构建低表达MALAT1的稳定细胞株.通过细胞的生长曲线和细胞划痕实验验证降低MALAT1对HeLa细胞增殖和迁移的影响.结果显示MALAT1表达水平在HeLa细胞中得到有效地降低, 低表达MALAT1的HeLa细胞生长速度和迁移速度减小.表明MALAT1在HeLa细胞中具有调控细胞增殖和迁移的能力     

EB病毒微小RNA在鼻咽癌中的表达及意义

采用实时荧光定量PCR分析EB病毒微小RNA(ebv-miR)ebv-miR-BART19-5p和ebv-miRBART21-3p在鼻咽癌和鼻咽炎症组织中的表达,以便探明其表达在EB病毒(EBV)致鼻咽癌中的内在联系和意义。结果表明,鼻咽癌组织中ebv-miR-BART19-5p和ebv-miR-BART21-3p的表达水平明显高于鼻咽黏膜炎症组织。EBV可能通过ebv-miR-BART19-5p和ebv-miR-BART21-3p的表达上调介导鼻咽组织癌变,它们可能是鼻咽癌治疗的分子靶点和鼻咽癌诊断的分子标志物。     

猪脑心肌炎病毒VR-129 B株VP2重组蛋白的构建表达及其免疫活性分析

为获得大量猪脑心肌炎VP2基因及蛋白研究的细胞模型,构建pDC315-EMCV-VP2真核表达载体,且将其转染到293T细胞,筛选出阳性质粒进行克隆。EMCV VR-129B株VP2基因序列参照GenBank(登录号:X74312),利用RT—PCR方法扩增VP2的全基因序列,将其与质粒pDC315经NheI和XhoI双酶切后连接,构建pDC315-EMCV-VP2重组表达质粒,并将其转染至293T细胞。使用荧光定量PCR方法观察pDC315-EMCV-VP2真核表达载体在细胞中的表达情况。双酶切PCR结果获得大小为780 bp的基因片段,测序结果显示与GenBank上已经公布的同名基因(登录号:X74312)序列片段同源性为100%,重组质粒构建成功。实时荧光定量PCR(QPCR)结果显示,重组质粒转染组与空质粒组之间相比,EMCV-VP2基因的表达量显著上调(P0.001);在荧光显微镜下观察转染细胞,转染成功部分出现较亮绿色荧光,EMCV-VP2基因表达稳定。从转染细胞中提取重组蛋白与EMCV阳性血清和阴性血清进行ELisa反应,具有较好免疫活性。     

猪Zfx基因RNAi片段的筛选

为了研究Zfx基因在精子发生过程中的作用,本实验利用RNA干扰技术针对猪Zfx基因m RNA的不同靶位设计构建了4个不同的sh RNA干扰载体:3个RNAi-Ready-p SIREN-Retro Q-Zs Green(p SIREN)质粒重组载体(a、b、c),1个p LL3.7慢病毒骨架质粒重组载体(p LL3.7-sh RNA)。通过对仔猪睾丸体外培养生精细胞中的Zfx基因进行人为干扰后,提取总m RNA,利用q RT-PCR对Zfx基因m RNA表达进行丰度测定。结果表明:p SIREN质粒重组载体干扰组对Zfx基因没有明显地作用,慢病毒骨架质粒重组载体干扰组对Zfx基因表达抑制效果显著,抑制率为51%(P﹤0.05)。结论:筛选获得了慢病毒骨架质粒重组干扰载体,其对仔猪睾丸体外培养生精细胞中的Zfx基因表达具有显著地干扰作用。     

猪繁殖和呼吸综合征病毒ORF7基因的克隆与序列分析

根据猪繁殖和呼吸综合征病毒（PRRSV）已发表的核苷酸序列,设计了1对特异性引物P1／P2,用RT-PCR扩增了PRRSV福建毒株FJ-1和FJ-2的全长核衣壳蛋白基因（ORF7）,将扩增产物连接到pUCm-T载体并转化大肠杆菌DH10B,提取阳性重组质粒进行序列测定与分析．结果表明：FJ-1和FJ-2毒株ORF7基因均为372bp,编码123个氨基酸,与美洲型参考毒株VR-2332及欧洲型参考毒株LV的核苷酸同源性分别为95．16％,94．35％和61．40％,60．65％,其推导的氨基酸同源性分别为95．93％,95．12％和56．49％,55．73％．研究表明,福建流行的FJ-1和FJ-2属于美洲型PRRSV毒株．     

CO与HO2或NO2反应机理的计算研究

用密度泛函DFT（B3LYP）方法和MP2从头算方法,在6-311G（d,p）,6-311＋＋G（d,p）基组水平上研究了CO＋HO2-C02＋OH,CO＋NO2-CO2＋NO2个反应的过渡态结构和反应机理,沿IRC分析指出反应均为协同完成的一步反应．同时计算了2个反应的活化位垒和反应焓变,并与实验估计值进行了比较．对CO与H02的反应采用MP2／6—311＋＋G（d,p）方法,计算所得反应位垒为100．98kJ／mol,与实验估计值93．60kJ／mol基本接近,对CO与N02的反应采用B3LYP／6—311＋＋G（d,p）方法,计算所得反应位垒为115．99kJ／mol,比实验估计值141．51kJ／mol低25．52kJ／mol．计算同时表明2个反应均为放热反应．     

X连锁凋亡抑制蛋白对肺癌细胞生长和细胞周期的影响

为了研究靶向X连锁凋亡抑制蛋白的发夹状RNA对肺癌细胞中抗肿瘤作用,构建XIAP基因的shRNA表达载体,并设计阴性对照(psiRNA-Con)质粒,分别转染A549细胞;实时定量PCR和免疫印记法分别检测XIAP的mR-NA和蛋白的表达;四甲基偶氮唑盐试验(MTT)检测A549细胞的增殖;流式细胞术检测细胞周期分布。实验结果表明:转染psiRNA-XIAP组细胞XIAP mRNA和蛋白水平均低于正常对照组,生长慢于正常组(t=16.82和t=12.13,均P<0.01),G2/M期细胞所占比例增高(t=3.78,P<0.05),并出现亚G1峰。而阴性对照质粒psiRNA-Con未能下调XIAP的表达水平,对A549细胞增殖和细胞周期亦无明显影响。结论:针对XIAP的RNA干扰质粒特异性地抑制了其RNA和蛋白水平,使肺癌细胞A549生长减慢,诱导凋亡,并使其发生G2/M期阻滞,有望发展为新的抗肿瘤药物。