α—干扰素、异搏定协同逆转肾癌细胞药物耐受性

目的：α－干扰素（α－ＩＦＮ）、异博定（ＶＲＰ）对ＲＣＣ－９２５肾癌细胞阿霉素敏感性的影响。方法：（１）将ＲＣＣ－９２５肾癌细胞分别与不同浓度的逆转剂α－干扰素或异搏定或α－干扰素＋异搏定及与不同浓度阿霉素（ＡＤＭ）共同培养;ＭＴＴ法检测肿瘤细胞的存活率。（２）图像分析仪检测逆转前后ＰgP(P-glycoprotein)4表达。结果：单独应用α－干扰素无逆转作用,联合应用α－干扰素、异搏定显著逆转肿瘤细胞的耐药性,效果优于单用异搏定（Ｐ＜０．０５）;２．５mg/L异搏定＋５００pg/mLα－干扰素共同与细胞作用后,PgP表达降低。结论：α-干扰素、异搏定作为逆转剂联合使用,能显逆转RCC－925细胞的耐药性,可望为临床耐药肿瘤的治疗提供一种新的方法。     

α-干扰素、异搏定协同逆转肾癌细胞药物耐受性

目的 :探讨α -干扰素 (α -IFN)、异搏定 (VRP)对RCC - 92 5肾癌细胞阿霉素敏感性的影响。方法 :( 1)将RCC - 92 5肾癌细胞分别与不同浓度的逆转剂α -干扰素或异搏定或α -干扰素 异搏定及与不同浓度阿霉素 (ADM)共同培养 ;MTT法检测肿瘤细胞的存活率。 ( 2 )图像分析仪检测逆转前后PgP(P -glycoprotein)表达。结果 :单独应用α -干扰素无逆转作用 ;联合应用α -干扰素、异搏定显著逆转肿瘤细胞的耐药性 ,效果优于单用异搏定 (P <0 0 5) ;2 5mg/L异搏定 50 0pg/mLα -干扰素共同与细胞作用后 ,PgP表达降低。结论 :α -干扰素、异搏定作为逆转剂联合使用 ,能显著逆转RCC - 92 5细胞的耐药性 ,可望为临床耐药肿瘤的治疗提供一种新的方法。     

猪α干扰素在BHK-21细胞中的表达与生物活性分析

为了构建猪α-干扰素(PoIFN-α)的真核表达系统,鉴定其生物学活性,分离猪的外周血淋巴细胞,提取总RNA,利用RT-PCR技术扩增猪α-干扰素基因序列,克隆至pcDNA3.1(+)载体,并转染BHK-21细胞。通过G418筛选获得稳定转染的细胞株,采用real-time PCR及ELISA测定PoIFN-α基因在BHK-21细胞内的表达,利用淋巴细胞增值试验(MTT)检测表达蛋白的生物学活性。结果表明:稳定整合PoIFN-α基因的BHK-21细胞系其PoIFN-αmRNA的转录效率比阴性对照组提高1.52倍,蛋白表达量显著提高1.35倍。MTT试验表明真核表达PoIFN-α淋巴细胞增值活性与阴性对照组相比差异显著(P<0.01),表明BHK-21细胞表达的PoIFN-α具有良好的生物学活性,为开发新型抗病毒制剂奠定基础。     

家猪Ⅲ型干扰素的生物化学性质与抗病毒能力研究

根据(GenBank公布的家猪Ⅲ型干扰素序列,设计特异性引物,从猪肾细胞PK-15中调取了家猪干扰素PoIFN-λ1,-λ3的cDNA序列,构建成pcDNA3.1B-/PoIFN-λs真核表达载体,并进行表达及性质研究.首先检测了在中华仓鼠肾细胞(BHK-21)中的转录及翻译水平,发现PoIFN-λ1,-λ3分别具有1个及2个N端糖基化位点.其次,鉴定了PoIFN-λs在猪肾细胞IBRS-2及PK-15中对合成双链RNA poly I:C、口蹄疫病毒(FMDV)及伪狂犬病毒(PRV)的应答表达谱.此外,检测了PoIFN-λs在IBRS-2中诱导抗病毒基因及细胞因子的表达情况,结果显示PoIFN-λs可显著诱导MX、OAS、PKR等干扰素激活基因(ISGs)及细胞因子IL-6、TNF-α的表达.抗病毒实验表明,PoIFN-λs在PK-15/PRV及IBRS-2/FMDV系统均具有低于PoIFN-α12的抗病毒活性;但在与PoIFN-α12联合使用时,抗FMDDV效果增强,Real time PCR检测发现ISGs表达量协同升高.     

清热利湿与益气古典方剂逆转二甲基亚硝胺大鼠肝硬化的细胞生物学基础研究

探讨了清热利湿的茵陈蒿汤与益气的黄芪汤逆转二甲基亚硝胺(di methylnitrosamine,DMN)大鼠肝硬化的细胞生物学基础.采用0.5%DMN生理盐水溶液4周12次腹腔注射法制备大鼠肝硬化模型,造模成型后终止DMN刺激,分组予以不同功效方剂经口给药2周,获取样本作相关指标的检测.TUNEL染色原位检测肝细胞凋亡并计算凋亡指数,免疫组织化学及Western blot方法分别检测肝组织α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)、肝细胞生长因子α(he-patic growth factor-α,HGF-α)、CD68及基质金属蛋白酶13(MMP-13)的表达,明胶酶谱法检测基质金属蛋白酶2,9(MMP-2、MMP-9)的活性.与正常大鼠比较,模型大鼠肝细胞凋亡指数、CD68及α-SMA表达均显著增加,而HGF-α与MMP-13表达显著减少(P<0.01或<0.05);与同期模型对照组大鼠相比,茵陈蒿汤组大鼠肝细胞凋亡指数显著降低,CD68与MMP-13表达显著增加(P<0.01,P<0.05),黄芪汤组无显著变化;茵陈蒿汤组MMP-9活性显著增加(P<0.01)、而黄芪汤组显著降低(P<0.05);茵陈蒿汤组及黄芪汤组大鼠肝组织α-SMA表达均显著降低(P<0.01),而黄芪汤组显著低于茵陈蒿汤组(P<0.05),黄芪汤组大鼠肝组织HGF-α表达显著增加(P<0.05),MMP-2活性显著降低(P<0.05).这表明逆转DMN大鼠肝硬化的有效方剂具有不同的细胞生物学基础:茵陈蒿汤清热利湿的祛邪作用在于减少肝实质细胞的病理性凋亡、调控库普弗细胞功能;黄芪汤益气的扶正功效主要表现为抑制肝星状细胞活化及促进肝窦内皮细胞损伤的修复.     

α-生育酚琥珀酸酯对乳腺癌细胞中IAPs家族蛋白表达的影响

目的检测α-生育酚琥珀酸酯(-αTOS)对MCF7和MDA-MB-453乳腺癌细胞增殖以及细胞中凋亡抑制蛋白家族(IAPs)表达的影响。方法采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法测定-αTOS对人乳腺癌细胞MCF7和MDA-MB-453增殖的抑制作用,细胞分别接种于96孔板后用浓度为51、0、255、0、75、1001、25和150μmol/L的-αTOS处理48 h后检测;细胞经50μmol/L、100μmol/L-αTOS处理122、4、48 h后,用RT-PCR的方法检测细胞内c-IAP1和c-IAP2 mRNA的转录水平;用Western Blot的方法检测c-IAP1和c-IAP2的蛋白质表达水平。结果-αTOS对人乳腺癌细胞MCF7和MDA-MB-453有显著的增殖抑制作用,并表现为剂量依赖性,-αTOS对MCF7和MDA-MB-453的IC50值(细胞半数死亡的药物浓度)分别为132μmol/L和74μmol/L;RT-PCR结果显示,-αTOS使两个细胞系的c-IAP1的转录水平显著下降,且呈时间依赖性;但对c-IAP2的转录水平没有明显影响;Western Blot的结果发现-αTOS使得这两种细胞系的c-IAP1蛋白质翻译水平也呈下降趋势,该结果与mRNA转录水平下降相一致,对c-IAP2蛋白质的表达几乎无影响。因此,α-TOS可能通过抑制c-IAP1蛋白的表达而抑制MCF7和MDA-MB-453乳腺癌细胞的生长增值,a-TOS有望开发成为新的预防和治疗乳腺癌的有效药物。     

口服蛋氨酸造成的大鼠肾间质纤维化模型及其机制研究

目的:研究口服蛋氨酸造成的大鼠肾间质纤维化模型及叶酸的治疗作用,同时观察同型半胱氨酸对人近曲小管上皮细胞增殖的影响,并初步探讨其机制。方法:24只普通SD大鼠随机分成三组,分别灌以双蒸水,蛋氨酸,蛋氨酸+叶酸,120天后处死大鼠,测定血浆同型半胱氨酸浓度,观察肾间质纤维化程度及检测组织中E-钙连接蛋白的表达;同时培养人近曲小管上皮细胞,观察同型半胱氨酸单独处理及叶酸联合处理后细胞的增殖情况及α-平滑肌肌动蛋白、E-cad的表达。结果:(1)蛋氨酸组血浆同型半胱氨酸水平较对照组显著升高,肾间质出现一定程度的纤维化,组织中E-cad的表达显著下调。(2)细胞中E-cad的表达显著下调、α–SMA的表达显著增高,细胞增殖明显。(3)叶酸治疗能显著减轻蛋氨酸所致的高同型半胱氨酸血症和肾间质纤维化,上调E-cad的水平,降低α-SMA的表达,抑制细胞的增殖。结论:通过口服蛋氨酸促发高同型半胱氨酸血症能诱导肾间质纤维化,其机制可能与肾小管上皮细胞的异常增殖及肾小管上皮转分化有关;叶酸能对抗这一作用。     

PPARα活化增加肿瘤细胞对EGCG的敏感性的机制

 研究探索EGCG是否调节PPARα以及PPARα活化对EGCG的肿瘤抑制作用影响及其机制。首先利用CCK-8试剂盒检测细胞存活率,之后分别采用western blotting和real-time PCR检测蛋白质和mRNA表达水平;采用PPARα的特异性激动剂和特异性拮抗剂来改变PPARα的表达;应用荧光素酶报告基因系统及染色质免疫共沉淀研究PPARα对HO-1的调控。结果表明,随着EGCG浓度的增加,PANC1和A2780细胞的存活率逐渐下降。当EGCG处理肿瘤细胞后,PPARα蛋白水平会随着EGCG剂量的提高而增加。PPARα的特异性激动剂—氯贝特(clofibrate)能增加胰腺癌PANC1和卵巢癌A2780细胞对EGCG的敏感性,其机制是氯贝特能够抑制细胞保护性血红素加氧酶-1(HO-1)的诱导。荧光素酶报告基因实验和染色质免疫共沉淀实验(ChIP)表明,活化的PPARα能结合到HO-1启动子上的PPAR结合元件(PPRE)上并抑制HO-1的表达。研究表明,PPARα的活化能在转录水平对HO-1进行负调控,同时增加肿瘤细胞对EGCG的敏感性。     

姜黄素联合阿霉素对膀胱癌 T24生长抑制的协同作用

目的探讨姜黄素联合阿霉素对人膀胱癌T24细胞的生长抑制及其诱导肿瘤凋亡的协同作用.方法用不同浓度的姜黄素和阿霉素分别及联合作用T24细胞,用MTT法检测细胞增殖抑制率,流式细胞仪检测细胞凋亡和细胞周期分布.结果阿霉素和姜黄素联用时,能较大幅度增强姜黄素的抑制效果(P<0.05);流式细胞仪检测结果显示:姜黄素与阿霉素联合将细胞周期阻滞于S期.结论姜黄素联合阿霉素对膀胱癌细胞T24的生长有协同抑制效应,能提高阿霉素对人膀胱癌T24细胞的敏感性.     

尼古丁诱导人脐带间充质干细胞凋亡的机制

目的:探讨尼古丁作用人脐带间充质干细胞(MSCs)前后,一氧化氮(NO)、细胞内钙离子(Ca2+)的变化及α7 nAchR的表达情况.方法:采用硝酸还原酶法检测不同质量浓度尼古丁作用于MSCs后24、36、48h,MSCs内NO的释放情况;尼古丁作用MSCs 24 h,fluo - 3/AM染色,流式细胞仪检测MSCs内Ca2+变化;用RT - qPCR检测尼古丁作用后α7 nAchR的表达情况.结果:尼古丁作用MSCs 24、36 h后,各实验组NO水平显著高于对照组(P＜0.05),呈时间、质量浓度依赖性,但在48 h,质量浓度0.8与1.0 mg/mL组,NO水平低于对照组.尼古丁作用后,各实验组质量浓度(0.6、0.8、1.0 mg/mL)的Ca2+荧光强度分别为( 141.26±16.01)、(164.90±18.39)、(198.76±17.63),均高于对照组(119.30±14.14),其中质量浓度0.8、1.0 mg/mL组与对照组相比有显著差异(P＜0.05).MSCs可表达α7 nAchR,且尼古丁作用后表达水平增高,呈时间浓度依赖性.结论:尼古丁可上调人脐带MSCs的α7nAchR表达,并通过刺激MSCs释放NO、升高细胞内Ca2+从而致MSCs凋亡.     

姜黄素与阿霉素联合应用抗肿瘤的协同作用

研究姜黄素与阿霉素联合应用对人纤维肉瘤HT1080、人乳腺癌MCF-7、人肺癌A549细胞的增殖抑制作用及诱导肿瘤细胞凋亡的协同作用,探讨其抗肿瘤协同作用的机制,为临床寻找有效的化疗增敏剂提供实验依据和理论基础.MTT法测定细胞增殖抑制率,结果表明5μmol/L姜黄素与阿霉素联合用药对HT1080、MCF-7、A549细胞均表现出协同抗肿瘤作用;Hoechst 33258荧光染色观察A549细胞凋亡的形态学变化;Westernblot法检测A549细胞bcl-2蛋白的表达,结果表明姜黄素与阿霉素联合应用可显著诱导A549细胞发生凋亡,其协同抗肿瘤的机制可能与下调抑凋亡蛋白bcl-2表达有关.     

靶向碱基切除修复途径以克服结直肠癌细胞中的阿霉素耐药性

结直肠癌(CRC)具有非常高的发病率和死亡率，成为全球第三大最常见的恶性肿瘤和第二大最致命的癌症.阿霉素作为化学治疗药物，多年来一直广泛应用于癌症临床治疗，但由于其耐药性和副作用，治疗效果较为有限.已有研究证明，在癌细胞中DNA修复能力会大大增强，这在很大程度上会使得癌细胞在化学治疗药物引起的DNA损伤中存活下来. Flap核酸内切酶1(FEN1)在各种类型的癌细胞中表达较高，并在DNA损伤修复中起着关键作用.研究表明，FEN1抑制剂SC13显著增强了阿霉素的治疗效果，这种联合治疗可以通过激活cyclinD-CDK4-6/INK4/Rb通路进而抑制结直肠癌的细胞增殖，故靶向FEN1可为阿霉素在临床使用中提供一种新的策略.     

重组猪α-干扰素的纯化及生化性质鉴定

对巴斯德毕赤酵母高效分泌表达的猪α-干扰素(PoIFN-α)纯化工艺和纯化后重组蛋白的部分生化特性进行了研究,结果表明:猪α-干扰素(PoIFN-α)发酵液经离心、透析、过滤处理之后,依次利用亲和层析和离子交换层析使目的蛋白得到了纯化.经N端氨基酸测序,Westem-blot,对酸、热、巯基乙醇的稳定性和糖基化程度等检测后发现,所表达的猪α-干扰素N端氨基酸序列(前5个)正确,对酸和热基本稳定,二硫键对目的蛋白的活性至关重要,没有发现目的蛋白的糖基化.     

半枝莲多糖对小鼠S180肉瘤抑制作用的研究

探讨半枝莲多糖对体内S180肉瘤肿瘤抑制作用及相关机制.采用动物移植性肿瘤实验观察半枝莲多糖对小鼠体内肿瘤细胞生长的影响,ELISA法检测对荷瘤小鼠外周血血清中白细胞介素-2和干扰素-α质量浓度的影响.结果显示,半枝莲多糖对S180肉瘤生长的抑制率以中剂量为佳;各剂量组均对脾脏指数有显著性差异,能够提高S180荷瘤小鼠外周血血清中白细胞介素-2及干扰素-α的质量浓度,但中剂量最为显著,表明半枝莲多糖在小鼠体内具有抑制S180肉瘤的作用.     

重组人干扰素α-2b水针、粉针的稳定性及与干扰素标准品的比较研究

研究重组人干扰素α-2b(商品名:安福隆)的稳定性.采用细胞病变法(CPE)检测在4℃贮存条件下放置不同时段的干扰素α-2b水针、粉针和干扰素标准品的抗病毒能力,与标准品比较,评价了水针和粉针的稳定性.结果显示,在4℃的贮存条件下,干扰素α-2b水针和粉针的抗病毒能力基本相同;经两年贮存后,也没有明显地变化,且均比标准品抗病毒能力强.说明干扰素α-2b水针和粉针稳定性均较好,其辅料配方合理,可有效保护干扰素α-2b,减少其降解.     

盐酸埃克替尼通过激活蛋白激酶C诱导Tca8113细胞表达iNOS和凋亡

体外培养Tca8113细胞,随机分为4组,(1)对照组;(2)埃克替尼处理组(20μmo1/L);(3)PKC抑制剂Ro31-8220(3μmol/L)处理组;(4)埃克替尼+Ro31-8220组(20μmo1/L Icotinib,3μmol/L Ro31-8220),不同干预因素处理细胞4h.Western blot检测不同处理组的胞膜内的PKC-α的表达水平,iNOS ELISA检测试剂盒测定细胞的iNOS含量,Griess方法测定Tca8113细胞产生的NO水平,用DNA fragmentation检测Tca8113细胞的凋亡情况.结果表明埃克替尼组DNA fragmentation细胞凋亡及上清液的iNOS,NO较对照组均明显升高;埃克替尼组细胞膜的PKC-α蛋白表达量明显增加.用埃克替尼与PKC的抑制剂Ro31-8220共同处理Tca8113细胞后,胞膜的PKC-α,iNOS的蛋白表达水平及产生的NO能被Ro31-8220显著抑制,且PKC抑制剂Ro31-8220能逆转埃克替尼引起的Tca8113细胞凋亡.埃克替尼能诱导Tca8113细胞iNOS表达和NO生成增加并能诱导Tca8113细胞凋亡;埃克替尼能促进细胞膜内的PKC-α表达增加;埃克替尼诱导的Tca8113细胞iNOS表达和凋亡与PKC有关.     

视黄酸及干扰素对胃癌细胞系MKN45中p16,p21,c-myc基因表达的影响

目的探讨全反式视黄酸及干扰素两种因子对胃癌MKN45细胞的影响.方法将视黄酸及干扰素同时加入胃癌细胞系MKN45中进行细胞培养,用MTT法测定细胞的生长状况,并通过Northern blot和免疫组化测定p16,p21及c-myc的表达情况.结果干扰素(IFN)协同全反式视黄酸(ATRA)可有效地抑制MKN45细胞生长,癌细胞经联合用药诱导后p16和p21基因的表达水平提高,c-myc基因表达水平下降.视黄酸受体RARα基因在MKN45细胞中呈低水平表达,经ATRA和IFN诱导后表达水平提高.结论 ATRA联合IFN诱导可调节p16和p21基因的表达水平,抑制胃癌MKN45细胞生长,这可能与细胞中RARα基因高水平表达有一定关系.     

1,25-(OH)_2D_3对阿霉素肾病大鼠足细胞的保护作用

目的研究维生素D3[1,25-(OH)_2D_3]对阿霉素(adriamyicin,ADR)肾病大鼠足细胞损伤的影响。方法将60只ADR诱导的雄性SD大鼠随机分为阿霉素模型组(ADR)和维生素D3治疗组(ADR+1,25-(OH2)D3),另取30只大鼠作为空白对照组(control)。给予活性维生素D3进行干预,实验期间,每天观察和记录大鼠的行为和外观,并每周记录体重。于注射ADR后第2、4、6、8、10周采集大鼠24 h尿样,检测大鼠24 h尿蛋白定量(urine total protein,UTP)。腹主动脉采血,测定血清总蛋白(total protein,TP)、白蛋白(albumin,Alb)、总胆固醇(total cholesterol,TC)、肌酐(creatinine,Cre)和尿素氮(blood urea nitrogen,BUN),取肾并称肾重。透射电镜观察肾脏足细胞和基底膜的变化,肾组织nephrin蛋白表达的检测通过免疫组化技术实现。结果生化结果显示,同时期内,模型组大鼠UTP、Cre、BUN、TC水平比对照组明显升高(P0.05),TP、Alb显著降低(P0.05);与模型组相比,治疗组大鼠各项指标有明显的改善趋势(P0.05)。透射电镜结果显示,模型组大鼠肾小球内上皮细胞足突融合、脱落严重,胞体内出现异常颗粒;治疗组足细胞损伤有所修复。免疫组化结果显示,nephrin蛋白于肾小球足细胞胞膜处表达,对照组大鼠可见强阳性表达,模型组大鼠表达明显降低,活性维生素D3治疗后有所逆转。结论 1,25-(OH)_2D_3对阿霉素肾病大鼠足细胞损伤有修复作用:能够上调nephrin蛋白的表达,减少蛋白尿以及足细胞足突融合脱落,从而起到保护肾脏的作用。     

色胺酮在食管癌化疗耐药过程中的作用

为研究色胺酮对食管癌化疗药物顺铂耐药性的抑制作用及其作用机制,设计食管癌Eca109细胞及其顺铂耐药株Eca109/cDDP细胞的顺铂及色胺酮不同处理组,根据实验目的选择不同的处理方式.利用实时荧光定量PCR检测Eca109和Eca109/cDDP细胞中多药耐药基因1(MDR1)及谷胱甘肽-巯基-转移酶-pi基因(GST-pi)的mRNA表达水平;免疫印迹和免疫荧光技术检测Eca109细胞和Eca109/cDDP细胞中MDR1和GST-pi蛋白的表达水平;细胞计数试剂盒(cell counting kit,CCK-8)法检测细胞增殖以及基因敲降后的回补效果.结果表明:色胺酮不仅显著抑制了食管癌细胞顺铂耐药株Eca109/cDDP细胞中MDR1基因的表达,而且MDR1和GST-pi蛋白的表达也受到了显著的抑制;色胺酮不但能抑制Eca109细胞的增殖能力,对耐药株Eca109/cDDP细胞增殖也存在抑制作用;色胺酮逆转耐药性的能力依赖于对MDR1和GST-pi的表达抑制.综上分析,色胺酮能够通过抑制MDR1和GST-pi蛋白的表达来逆转食管癌细胞顺铂耐药株的耐药性,是一种潜在的化疗辅助药物.