阿维链霉菌种内原生质体融合选育仅产阿维菌素B的高产菌株

在阿维菌素的8个组分中, B1组分具有最高的杀虫活性, 且毒性最小, 被广泛应用于农业和畜牧业生产. 本研究对两株阿维链霉菌(阿维菌素高产菌株76-05和仅产阿维菌素B不产寡霉素的基因工程菌73-12)进行了种内原生质体融合, 用以选育仅产阿维菌素B不产寡霉素的高产菌株, 获得了两株具有双亲优点的重组菌株F23和F29. 两重组菌侏均只产阿维菌素B组分不产寡霉素, 而且阿维菌素的产量有很大的提高, 分别是亲本菌株76-05产量的84.20%和103.45%, 是亲本菌株73-12的2.66和3.50倍. F23和F29均为遗传稳定的原养型菌株, 与亲本菌株高产菌株76-05相比, F29对发酵条件比较宽容. F23和F29高产阿维菌素B不产阿维菌素的其他组分和寡霉素的特性有利于阿维菌素的生产, 而菌株F29对发酵条件相当宽容更有利于其在工业生产中的应用.     

细菌Ⅱ型分泌途径控制产碱假单胞菌(Pseudomonas alcaligenes) S2中卵磷脂酶的分泌

从水稻根际分离筛选出1株降解卵磷脂的有机磷降解细菌菌株S2, 通过形态指标、生理生化性状、16S rDNA序列、(G+C)含量以及DNA-DNA杂交分析, 鉴定为产碱假单胞菌(Pseudomonas alcaligenes). 采用双亲接合的方法将带有Tn5转座子的质粒导入产碱假单胞菌S2菌株中进行转座子插入诱变, 从5000个卡那霉素抗性的Tn5插入突变株中, 筛选到3株丧失解磷能力的突变株(M808, M1329和M1400)和1株解磷能力增强的突变株(M20). 对Tn5插入位点的基因进行DNA测序表明, 丧失解磷能力突变株中被突变的基因分别是xcpS, xcpX和xcpW, 它们分别编码XcpS, XcpX和XcpW蛋白, 这些蛋白是细菌Ⅱ型分泌途径中的主要成分. 将xcpS, xcpX和xcpW基因分别构建在pLAFR3载体上, 通过双亲接合的方式分别导入上述M808, M1329和M1400三个丧失解磷能力突变株中进行功能互补实验, 结果表明这3个基因都能使各自相对应的突变株恢复解磷能力. 以上结果表明, 在产碱假单胞菌中卵磷脂酶的分泌是通过Ⅱ型分泌途径来完成的. 解磷能力的丧失可能是由于Tn5插入xcp基因簇中的某一基因破坏了卵磷脂酶向胞外的分泌, 造成突变株不能降解有机磷. 在解磷能力增强突变株M20中, 被突变的基因与铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa) PAO1中的chpA基因(参与细菌的颤动)同源性达88%.     

阿维链霉菌adpA-a调控形态分化和黑色素形成

灰色链霉菌(Streptomyces griseus)中的AdpA是A-因子调控网络中的一个中心转录调控因子, 控制形态分化和次级代谢. 在阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis)的基因组上, 也存在着与adpA高度同源的基因adpA-a. 为了研究其功能, 通过同源双交换将adpA-a基因破坏, 得到的adpA-a突变株不能进行正常的形态分化, 同时不再产生黑色素, 但产阿维菌素(avermectin)的能力不受影响. 对该破坏菌株进行基因互补, 互补突变株的表型得到恢复, 证实了突变株表型变化是由adpA-a破坏引起的. 以上结果表明, 在阿维链霉菌中, adpA-a不仅参与形态分化的调控, 同时也参与黑色素生物合成的调控.     

MAPK和cAMP途径对白色念珠菌毒性与基因表达的影响

利用白色念珠菌MAPK和cAMP途径几种成员的基因缺失株,研究信号转导途径对白色念珠菌形态转变的影响。用系统感染小鼠模型分析这些基因缺失株的毒力。缺失株的毒力与它们形成菌丝的能力相一致,野生菌SC5314的致病能力最强,形成菌丝能力减弱的突变株hst7和cph1毒力也减弱,不能形成菌丝的cph1 efg1突变株和crk1则无毒性。Northern blot杂交分析表明,MAPK途径对ECE1和ALS3的表达影响不大,cAMP途径的影响较大,ECE1的表达依赖于Efg1因子。ALS1的表达受MAPK和cAMP途径共同调控,两者对ALS1表达的影响效应接近,在cph1 efg1双缺失株中ALS1,ALS3,ECE1的表达完全受抑制。     

人工光照条件下深红红螺菌的氢代谢途径

深红红螺菌(Rhodospirillum rubrum)在不同培养条件下分别有多种酶参与氢的代谢. 为研究R. rubrum在人工光照条件下氢代谢途径及各代谢途径对光合产氢的贡献, 分别构建了3个缺失突变株: Fe-固氮酶缺失单突变株、Fe-固氮酶和Mo-固氮酶双缺失突变株以及吸氢酶和Fe-固氮酶双缺失突变株. 比较R. rubrum野生型菌株、吸氢酶缺失单突变株及所构建3个突变株的固氮酶活性及光合氢产量. 结果表明, 在人工光照条件下, Mo-固氮酶和Fe-固氮酶是R. rubrum产氢的关键酶; 除Fe-和Mo-固氮酶外还有第3种途径参与氢代谢, 该代谢途径产生的氢气量较小. Mo-固氮酶、Fe-固氮酶和第3种途径对光合产氢的贡献率分别为93.5%, 4.9%和1.5%; 吸氢酶消耗13.3%的氢气. 甲酸裂解氢酶活性测定表明, 第3种产氢途径并非由甲酸裂解氢酶介导, 而可能是一种未知酶参与人工光照条件下R. rubrum的氢代谢.     

阿维菌素B产生菌寡霉素合成阻断株的构建

以仅产阿维菌素(avermectin) B和寡霉素(oligomycin)的阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis)CZ8-73为出发菌株, 构建基因缺失载体pXL05(pKC1139∷ΔolmA1 + ΔolmA4), 并将其转入CZ8-73中, 通过缺失质粒和染色体之间的同源双交换, 对染色体上长达90 kb的寡霉素PKS基因簇(olmA)进行了缺失突变. 将4株经Southern杂交验证正确的基因缺失突变株进行摇瓶发酵和HPLC检测, 发现4个突变株均不再产生寡霉素而仅产阿维菌素B组分, 阿维菌素的总产量和B1的产量与出发菌株相当, 说明寡霉素PKS基因簇的缺失并不影响阿维菌素的生物合成. 该缺失突变是在染色体上通过同源双交换完成的, 不会发生进一步的重组, 因此突变株性状稳定, 在工业生产上具有应用价值.     

利用RFLP数据进行定向染色体步移

染色体步移是分子遗传学一个十分重要的技术,它在分子克隆上运用得日益广泛.但是,通常我们不能决定染色体步移的方向,从两个方向步移既费时又费力.本文阐述了一个能够确定染色体步移方向的方法.借助于这个方法,在粗糙脉孢霉成功地克隆了os-1基因.这个方法对其它生物也有借鉴意义.os-1突变株对高渗透压敏感,它在含4%氯化钠的固体培养基上不能生长.os-1在表型上与野生型很不相同.os-1突变株的无性孢子聚集成团,并带橘红或紫色.在非允许温度下,一个温度敏感型os-1突变(等位基因:NM233t)在含山梨糖和多氧菌素B的液体培养基     

产酸克氏杆菌(Klebsiella oxytoca)钼铁蛋白α-423~(Ile)位点的突变导致固氮酶催化活性降低

基于前期对固氮酶催化过程中存在两条电子传递通路的推论,探索从与P原子簇共价相连的β-93Cys出发至FeMoco之间重要的氨基酸位点.通过分析固氮酶钼铁蛋白的结构,利用体外定点突变和基因替代技术,将产酸克氏杆菌(Klebsiella oxytoca)固氮酶β-102Asn,α-431Lys和α-423Ile位点分别替换为β-102Ala,α-431His和α-423Pro,获得Nβ102A,Kα431H和Iα423P突变株.3个突变对细菌固氮生长有不同程度的影响,其中Iα423P突变株几乎无固氮生长,细胞乙炔还原活性显著下降;在42 L发酵罐中培养,其细胞最高固氮酶活性仅为野生型菌株的1/6;qRT-PCR检测发现此突变株nifD基因4倍的上调表达.分离纯化Iα423P钼铁蛋白,其最高C2H2和H+还原水平分别为野生型的13%和21%.根据以上研究结果推论,突变固氮酶的催化活性显著降低,或与直接打破α-423Ile与高柠檬酸长臂之间的氢键有关,推测α-423Ile是固氮酶催化底物还原过程中,电子经高柠檬酸长臂进入活性中心Mo位的入口氨基酸.     

磁螺菌(Magnetospirillum gryphiswaldense)氢酶基因功能分析及对细胞生长的影响

探讨了磁螺菌(Magnetospirillum gryphiswaldense MSR-1)氢代谢与细胞生长、磁小体合成之间的关系. 分别构建了吸氢酶大亚基基因hupL缺失突变株L206和氢酶大亚基基因hyaB与hupL的双缺失突变株B206. 比较了野生型菌株与突变株在摇瓶培养条件下的吸氢量、放氢量、细胞生长曲线和铁的吸收, 并结合电子显微镜观察了细胞内磁小体合成情况. 结果表明, 磁螺菌HupSL为专一性的吸氢酶, HyaAB为专一性的放氢酶; L206在磁小体合成过程中的放氢量相对较高, 其生长速度、铁吸收速度明显快于MSR-1及B206. 推测磁螺菌可通过上述吸氢酶和放氢酶的作用适当调节细胞内还原力的平衡, 促进铁的吸收和磁小体合成.     

组成型nifA对大豆根瘤菌(Rhizobium fredii))HN01lux结瘤固氮效率的促进作用

肺炎克氏杆菌(Klebsiella pneumoniae)固氮调节基因nifA对大豆根瘤菌(Rhizobium fredii)HN01lux的结瘤固氮效率有促进作用.首先构建一个带有Kp nifA的重组质粒pXD1,使nifA在卡那霉素磷酸转移酶基因启动子控制下呈组成型表达.当质粒pXD1转移至大豆根瘤菌RfHN01lux后,获得带Kp nifA的大豆根瘤菌,其结瘤固氮效率与原始出发菌相比有明显提高,感染大豆幼苗后,大豆生物量的增加,如植株株高、植株鲜重、植株干重及大豆产量均优于原始出发菌.     

赤霉素代谢及其调控相关基因的差异表达与小麦株高杂种优势的关系研究

植物杂交F₁的株高一般都表现出明显的杂种优势, 但其形成的分子机理迄今尚未阐述清楚. 本研究以按照NCⅡ遗传交配设计配制的16个杂交组合为材料, 在田间株高性状杂种优势测定的基础上, 采用实时定量PCR技术检测了赤霉素代谢及其调控相关基因在杂交种与亲本抽穗期穗下第1节中的表达情况, 并且与株高杂种优势进行了相关分析. 结果表明, 所有杂交组合的株高和第1节均表现出明显的杂种优势, 但因杂交组合和株高性状不同而存在很大的差异. 分析发现, 第1节与株高的中亲杂种优势之间的相关性达到了显著水平(r = 0.56, P < 0.05), 说明该节对小麦株高杂种优势的形成有重要的贡献. 实时定量PCR表达分析结果显示, 赤霉素代谢及调控相关基因的表达优势因杂交组合不同而存在明显的差异, 但第1节杂种优势与KS, GA3ox2-1, GA20ox2, GA20ox1D, GA-MYB和GID1-1基因的表达优势呈显著或极显著正相关, 而与GAI和GA2ox-1基因的表达优势呈极显著负相关, 这与我们最近提出的小麦株高杂种优势形成的赤霉素分子调控模型相吻合, 说明赤霉素代谢及调控相关基因的表达改变与株高杂种优势的形成有重要关系.     

运用RAPD分析标记水稻耐盐突变系的耐盐主效基因

将稳定遗传的水稻耐盐突变系与其原始品种杂交 ,F2 代的遗传分析表明能正常结实的耐盐株与不能结实株分离比约为 3∶1.表明突变由核基因控制 ,并存在主效基因 .经耐盐纯合株和盐敏纯合株构建的两个耐、敏池的BSA分析 ,得到一条 1kbDNA条带与耐盐主效基因连锁 .并定位于水稻第七条染色体上 ,距主效基因约 16 4cM .     

水稻穗顶退化突变体paa1331的鉴定及基因定位

水稻穗部是影响产量的重要农艺性状,其发育健全与否直接决定了水稻产量的高低.过去几十年已经有大量的粒型和穗粒数相关基因被克隆报道,但调控穗顶发育相关基因的克隆与功能的报道较少.本研究通过甲基磺酸乙酯(EMS)诱变籼稻品种宜香1B,筛选到一个能稳定遗传的穗顶退化突变体材料paa1331(panicleapical abortion1331).与野生型相比,该突变体主要表现为穗顶端严重退化(退化率高达53%),株高变矮,分蘖减少,穗粒数降低.台盼蓝染色结果表明,穗顶端退化伴随细胞程序性死亡;激素测定结果证明,突变体穗顶部生长素含量高于野生型.遗传分析表明,该突变性状受隐性单基因控制;通过图位克隆与重测序分析发现,基因LOC_Os04g40720第4外显子的碱基A突变成G,导致编码的氨基酸由天冬酰胺变为天冬氨酸.目前该基因未见报道,暂将该基因定为候选基因.     

苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti) nifA基因通过诱导宿主防卫反应调节根瘤的形成

苜蓿中华根瘤菌nifA基因是固氮基因的正调节因子, 本文研究了nifA基因对根瘤形成的调节作用. 在分裂根实验中, nifA突变株对另一侧根的结瘤抑制率比野生型菌下降43.7%, 感染突变株植物合成的植保素和形成的坏死细胞的数量也相应减少, 与植物防卫反应相关的苯丙氨酸解氨酶基因、查儿酮合成酶基因和几丁质酶基因不能表达. 这些结果说明, 苜蓿中华根瘤菌nifA基因通过诱导宿主植物的防卫反应对根瘤的形成进行调节. 虽然nifA突变株在宿主植物上引发根瘤的数量增加, 它合成的结瘤因子的量却比野生型菌株少. 因此, 可以推测nifA基因介导了多种信号途径对根瘤的形成进行调节.     

Klebsiella oxytoca HP1 adhE基因插入失活法构建产氢重组菌

乙醇是产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca) HP1厌氧发酵产H₂的主要副产物, 每生成1.0 mol的乙醇需要消耗2.0 mol NAD(P)H, 从而降低了H₂的产量. 本研究以编码乙醇脱氢酶系(含乙醛脱氢酶和乙醇脱氢酶活性)的adhE基因为改造目标, 利用同源重组技术获得了以提高产氢为目标的K. oxytoca重组菌. 构建工作包括: 根据adhE基因保守序列框克隆K. oxytoca HP1 adhE基因片段, 以质粒pMHE6为模板进行链霉素抗性基因表达盒的扩增, 表达链霉素抗性的aadA基因片段和adhE基因片段分别与载体pMD18-T相连构建重组质粒, 同源整合质粒pTA-Str的构建, 以链霉素作为筛选标记筛选重组菌. 菌落PCR鉴定结果表明, aadA基因表达盒通过质粒pTA-Str的介导已定点插入K. oxytoca HP1基因组中, 成功地构建了adhE基因部分片段缺失的重组菌. 葡萄糖发酵实验结果表明, 相同发酵条件下, 重组菌比野生菌的产氢量提高了16.07%, 乙醇产量下降了70.47%. 利用基因工程技术提高产氢初步获得成功.     

固氮粪产碱菌ntrC 基因部分缺失突变株的构建及其特性

为研究粪产碱菌ｎｔｒＣ基因表达产物对其他固氮基因表达的调节功能,构建了ｎｔｒＣ基因的部分突变株。将粪产碱菌Ａ１５０ｎｔｒＣ基因克隆于自杀性质粒ｐＵＳＰ２０２上,获得重组质粒ｐＳＵＭ１,将ｌａｃＺ－Ｋｍ,Ｋｍ基因片段替换重组质粒中的ｍｔｒＣ片段,获得ｎｔｒＣ部件缺失的自杀性质粒ｐＳＵＭ２,ｐＳＵＭ３。采用同源重组双交换法将上述两质粒与野生型Ａ１５０１中的ｎｔｒＣ同源片段转换,获得ｎｔｒＣ部分缺失突变     

转抗细胞凋亡基因p35黏虫细胞克隆株研究

通过脂质体介导的方法将抗细胞凋亡p35基因导入黏虫细胞系Ms7311, 经Zeocin抗性筛选和细胞克隆, 获得了转基因细胞株TMs7311. PCR检测证明, 转基因细胞株基因组DNA中含有p35基因特异扩增谱带. 该转基因细胞株形态与原始细胞系不同, 生长速度快, 群体倍增时间为25.4 h, 对磷酸缓冲液(PBS)有较强的营养抗性, 能抑制放线菌素D诱导的细胞凋亡; 病毒产量和β-半乳糖苷酶(β-galactosidase)以及碱性磷酸酶(secreted alkaline phosphatase, SEAP)的表达水平明显高于原始细胞系Ms7311, 是一株高表达重组蛋白和高产杆状病毒的优良细胞株.     

白色念珠菌中转录因子CaSfl1在转录调控中的双重作用

CaSfl1作为白色念珠菌中新鉴定出来的一个转录因子, 已被证明参与了细胞的丝状生长以及细胞的絮凝, 并且对菌丝生长相关基因的转录起到负调控作用. 本研究通过基因敲除的方法获得了Casfl1Δ/Δ缺失突变体, 证实了CaSFL1的缺失的确会导致细胞的丝状生长以及细胞的絮凝. RT-PCR结果表明, CaSfl1作为转录因子, 除了对与细胞形态相关的HWP1, ECE1, ALS1, ALS3, FLO8基因的转录水平起负调控作用外, 还对热激蛋白HSP30, HSP90在应激条件下的转录水平起正调控作用. 可以推测, 在白色念珠菌中, CaSfl1既能促进转录, 同时也能抑制转录, 即具有双重转录调控作用.     

深红红螺菌draTGB hupL双突变株在不同光照条件下的放氢

为提高深红红螺菌(Rhodospirillum rubrum)在两阶段培养条件下的放氢量, 分别构建了缺失吸氢酶大亚基基因hupL的单突变株R. rubrum UR801和缺失固氮酶活性调节因子基因draTGB与hupL的双突变株R. rubrum UR805. 对比测试了这两个突变株与野生型菌株R. rubrum UR2和UR472 (ΔdraTGB)在不同光照条件下的放氢量. 结果表明, 在持续光照条件下, R. rubrum UR801的氢产量最高, 可达5700 mL/L, 分别为R. rubrum UR2, UR472和UR805氢产量的1.56, 2.24和2.32倍; 而在两阶段培养条件下, R. rubrum UR805的氢产量最高, 可达4303 mL/L, 分别为相同条件下R. rubrum UR2, UR801和UR472氢产量的1.35, 1.21和1.04倍. 据此, R. rubrum UR805有望作为两阶段培养条件下大量放氢的菌株.     

利用绿色荧光蛋白研究大豆疫霉与大豆的互作

利用卵菌Bremia lactucae的hsp70启动子和ham34终止子序列, 将外源绿色荧光蛋白(green fluorescent protein, GFP)基因转化进大豆疫霉. 利用荧光显微镜观察了gfp基因在大豆疫霉不同发育阶段的表达. 另外, 利用该报告基因系统观察了大豆疫霉在寄主大豆叶片、下胚轴和根部的侵染行为以及显微分析了不同抗性的大豆品种抗大豆疫病在根部的差异. 结果表明, gfp基因能够在大豆疫霉中稳定表达, 在菌丝、游动孢子囊、游动孢子、休止孢、卵孢子阶段都能够观察到绿色荧光; 以GFP作为标记可以实时地观察到大豆疫霉在寄主体内的侵染过程, 发现大豆疫霉在抗性大豆品种根部表面萌发的芽管明显长于在感病品种根部萌发的芽管长度. 结果表明, GFP可以作为大豆疫霉遗传研究中有价值的分子标记.