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采用重组小鼠凝血因子Ⅸ制备单克隆抗体的研究 总被引:2,自引:0,他引:2
将小鼠凝血因子Ⅸ (mFⅨ )cDNA蛋白编码区序列克隆至原核表达载体 pQE30 ,在大肠杆菌M 15中获得高效表达 (约占细菌蛋白总量的 5 1 2 % ) ,并经过SDS PAGE纯化获得均一的重组mFⅨ蛋白 .以此蛋白为抗原 ,免疫Lou/MN系大鼠 ,取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞 (Sp 2 / 0 )融合后 ,经 3次克隆化选择获 2株杂交瘤细胞(H4B5和C2B10 ) .以 1× 10 6杂交瘤细胞注射免疫缺陷型裸鼠 ,10d后获得腹水 .对此单抗的功能和特异性初步研究表明 ,所制备的抗小鼠FⅨ单抗可用于Western免疫印迹等研究 . 相似文献
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构建了带有人hFⅨ cDNA及不同调控顺序的重组质粒和反转录病毒载体,系统比较了不同启动子,增强子在不同靶细胞中对hFⅨ cDNA表达的作用,MoMLV病毒的LTR启动子在小鼠成纤维细胞中控制转录能力较强,还研究了hFⅨ基因自身内含子Ⅰ及IL-2基因内含子对hFⅨ cDNA的表达增强艇,并就双启子和选择基因对hFⅨ cDNA表达的影响进行了实验探讨。 相似文献
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小鼠凝血因子Ⅸ基因组DNA的结构分析和ES细胞基因打靶研究 总被引:1,自引:0,他引:1
为了利用ES细胞基因打靶技术建立人血友病B的转基因小鼠模型,用小鼠FIX基因cDNA为探针,筛选129Sv小鼠的基因组DNA噬菌体文库,从2*10^5个噬斑中得到5个独立的阳性噬菌体克隆。 相似文献
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ZHUHuanzhang CHENXiaoguang LIFeng GONGJuli XUEJinglun 《科学通报(英文版)》2003,48(20):2196-2200
To explore the expression of human clotting factor Ⅸ (hFⅨ) cDNA in vitro and the feasibility of gene therapy for hemophilia B mice mediated by recombinant lentiviral vector, a recombinant hFⅨ lentiviral vector driven by ubiquitin-C promoter, FUXW, and by ABP liver specific promoter, FAXW, was constructed respectively. Recombinant lentivirus was harvested from 293T cells by calcium phosphate-mediated transient cotransfection of three plasmids (transgene vector, CMV腞8.2, VSV-G). hFⅨ expression was detected in supernatant of 293T, BHK and L-02 cells infected with FUXW virus, whereas higher expression of hFⅨ levels (630 ng/106 cells/48 h) was detected only in L-02 cells infected with FAXW virus. Serum hFⅨ antigen was detected in all hemophilia B mice treated with FAXW virus by tail vein injection, an efficiency level of hFⅨ was observed (45 ng/mL, approximately 1% of normal human levels), the expression lasted for more than 60 d. The results indicated that HIV-based lentiviral vectors offer a promising approach to the gene therapy of hemophilia B. 相似文献
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电击法转移含人凝血因子Ⅸ基因重组质粒的影响因素 总被引:2,自引:0,他引:2
反转录病毒载体在基因治疗中可能会产生野生型病毒而引起安全性问题,本文研究含FIXcDNA重组质粒基因治疗血友病B的可能,构建了不具反转录病毒载体结构的两重组质粒pSCIXTN和pCIXTN,前者含SV40早期启动子和hCMV启动子共同控制的FIX cDNA,后者仅含hCMV启动子控制的FIXcDNA,它们都含有TK启动子驱动的neo基因,通过电击法将基因转移到PA317和HT1080细胞,在HT1 相似文献
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凝血因子IX的检测是血友病B基因治疗研究中的重要工作,在实验室原有基础上,发现和完善了凝血因子IX在蛋白质水平上的检测系统,为基因治疗血友病B提供了更为直观可靠的依据。首先,建立了以鼠抗人FIX单克隆抗体A-7为一抗的检测活性FIX蛋白量的ELISA法,为检测活性FIX提供了快速简便的方法。其次,实现了用Westernblot法检测转染细胞培养液上清中FIX,确证了体外培养的转有人FIXcDNA细 相似文献
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血友病B是凝血因子Ⅸ(hFⅨ)缺乏所导致的严重凝血功能障碍、X-连锁隐性遗传性疾病,在男性中的发病率为三万分之一.目前没有理想的治疗措施,而基因治疗可能是根治该病的安全、有效方法.该实验构建了ubiquitin—c和ABP(肝特异性)启动子指导hFⅨ表达的载体FUXW、FAXW,利用磷酸钙法共转染三质粒制备高滴度的重组慢病毒.将不同剂量的重组FUXW、FAXW病毒,分别用尾静脉液压法和静脉缓注法注射入血友病B小鼠体内,各治疗组小鼠血浆均可持续检测到hFⅨ抗原,最高峰值为45ng/mL,表达持续超过60d.结果表明:hFⅨ蛋白的表达与病毒的剂量成正相关,重组FAXW病毒的hFⅨ表达量高于重组FUXW病毒,而尾静脉液压组和静脉缓注组在表达量、表达时间上没有显著差异. 相似文献
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小鼠造血干细胞的分离、培养及重组慢病毒载体介导的离体hFⅨ基因表达 总被引:2,自引:0,他引:2
造血干细胞是基因治疗理想的靶细胞之一,尤其适用于遗传性血液病.而重组慢病毒载体能高效感染造血干细胞,成为造血干细胞途径基因治疗的理想载体.从小鼠骨髓细胞中分离出单个核细胞(MNCs)进行体外悬浮培养,并用免疫磁珠法分离得到高纯度的小鼠Lin-CD117+造血干细胞(HSCs).体外悬浮培养期间,添加细胞因子的造血干细胞的细胞数和集落数逐渐增加,而未添加细胞因子的对照组的细胞数量无明显增加,细胞集落递减.用磷酸钙介导的共转染法制备了携带FⅨ基因的FUXW重组慢病毒,用慢病毒载体分别感染从ICR小鼠和C57小鼠中分离得到的MNCs,7d后测得细胞上清中hFⅨ的表达量分别为41.7±4.2和34.5±6.6ng/mL,而慢病毒感染C57小鼠造血干细胞,添加细胞因子组上清中hFⅨ的表达量为46.6±5.7ng/mL,不添加细胞因子组为33.3±4.8ng/mL.实验结果表明,重组FUXW慢病毒载体可有效感染小鼠单个核细胞和Lin-CD117+造血干细胞,添加细胞因子可提高转移基因的表达量. 相似文献
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杂交鹅掌楸体胚系统的遗传稳定性研究 总被引:1,自引:0,他引:1
以1999年建立的杂交鹅掌楸体细胞胚胎发生体系为研究材料,进行长期继代培养的胚性细胞系的增殖能力及再生植株遗传稳定性研究。结果表明:建立的体细胞胚胎再生体系经过3a甚至6a的继代培养,能够保持旺盛的体胚发生能力;染色体计数发现多数细胞系的再生植株遗传稳定性较好,为二倍体再生植株,仅在一个细胞无性系当中发现所有再生植株均为四倍体。 相似文献
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为了获得耐盐性有所提高的转AlNHX1基因大豆后代材料,以已获得的转AlNHX1基因的6个株系中的3个株系后代为研究对象,通过分别对这3个株系转基因大豆各后代进行PCR分子检测并结合耐盐性鉴定,以分析外源基因在转基因大豆中遗传稳定性和耐盐性.结果表明:AlNHX1基因在转基因植株的后代中遗传;选取3个株系中部分阳性植株做耐盐性检测,结果表明:转基因大豆耐盐性状均好于野生型大豆.在150mmol/L NaCl胁迫下,转基因大豆叶片中维持了相对较高的K+/Na+比值,相对含水量较野生型提高了9%,而渗透势降低了39%,表明转基因大豆具有较好的吸水和保水能力;在盐胁迫下,超氧化物歧化酶(SOD)与过氧化物酶(POD)活性较野生型大豆分别提高了45%与69%.综上,通过耐盐筛选获得的转AlNHX1基因大豆具有较强的耐盐性. 相似文献
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按Eberhart&Russell的品种遗传稳定性分析方法,以陕蚕三号、陕蚕四号各原原母种的茧质性状成绩作为分析对象.结果表明全茧量、茧层量性状的稳定性受环境的影响相对较大,而受品种及品种与环境互作的影响相对较小;茧层率性状的遗传稳定性受品种的影响相对较大,而受环境和品种与环境互作的影响相对较小.茧层率性状遗传稳定性的回归系数代表性好,表明其回归系数的线性关系成立.129,797,795,796品种的综合遗传稳定性相对较好. 相似文献
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铁皮石斛不同繁殖代数遗传稳定性RAPD的研究 总被引:9,自引:0,他引:9
研究铁皮石斛单蒴果种子内不同无性繁殖代数的遗传稳定性.利用从100个随机引物筛选出23个稳定性较好的10碱基引物,对来自单蒴果的7代无性繁殖种苗进行RAPD检测.发现7代无性繁殖的组培苗内代代之间遗传距离很小,但代数相差越大其遗传距离就越大,在0~0.043 5范围内.其中在1~3代未探查到变异,但从第4代始,有部分引物RAPD带型发生变化,但变化甚微.23个稳定引物只探查到了7个变异位点.铁皮石斛组培过程中种内存在一定的变异,但变异甚微,所以建立铁皮石斛稳定的无性快繁体系是切实可行的. 相似文献
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本实验从解离条件、取材时间、培养时间、预处理药剂与时间等方面探讨了翅果油树愈伤组织染色体观察的制片方法,并在细胞水平上对翅果油树愈伤组织的染色体稳定性进行了研究.得出了翅果油树愈伤组织的最佳制片方法.翅果油树的染色体在组织培养过程中存在着一定程度的变异,且其变异率随继代次数的增加呈上升趋势.但细胞学的变异只能解释少数较极端的无性系变异,更多的无性系变异则有待于从DNA水平和生化水平进一步研究. 相似文献
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张晓博 《信阳师范学院学报(自然科学版)》2012,(2):281
我校生命科学学院马云博士获批国家自然科学基金项目:调控黄牛脂肪代谢类血管生成素相关基因遗传特征及其网络关系研究,项目编号:31172193.肝脏是哺乳动物脂肪代谢平衡调控的重要器官. 相似文献