斑马鱼CFL基因的克隆、多克隆抗体的制备及分析

在心脏发育过程中,相关基因的正常表达是有功能心脏形成的关键．斑马鱼CFL基因是从斑马鱼胚胎的cDNA文库中克隆出来的一个心脏发育候选基因．生物信息学分析表明：CFL基因编码278个氨基酸,含有一个CXXC结构域．为进一步研究该基因的功能,采用生物信息学结合RT-PCR的方法获得了该基因．将所得片段插入原核表达载体pET-28a载体中,经测序鉴定正确后转化入Rosetta菌株中,用IPTG诱导表达出pET-28a－CFL融合蛋白,表达的融合蛋白占菌体总蛋白的71％,融合蛋白相对分子质量约为30kD．经包涵体纯化后,免疫新西兰大白兔制备了多克隆抗体．经验证,具有较好的特异性和较高的效价,可以用作western－blot免疫印迹等实验分析．     

斑马鱼Nfatc3基因多克隆抗体的制备及检测

为了在斑马鱼模型中更深入地研究Nfatc3蛋白在心脏发育中的功能,采用PCR技术扩增斑马鱼Nfatc3基因的部分编码区并插入pET-28a表达载体中,之后将重组质粒转入大肠杆菌（E.coli）通过IPTG诱导表达His-Nfatc3融合蛋白,对该融合蛋白采用Ni-IDA凝胶柱层析纯化后,免疫新西兰兔制备了多克隆抗体,并用western blotting对抗体进行分析.结果表明获得了高效价的特异性兔抗Nfatc3多克隆抗体.这为Nfatc3功能的进一步研究奠定了基础.     

GGPPS多克隆抗体的制备与鉴定

构建人香叶基香叶基二磷酸合成酶基因(GGPPS)原核表达载体,制备兔抗人GGPPS多克隆抗体.利用DNA重组技术构建原核表达载体pGEX-4T-GGPPS,诱导表达GGPPS融合蛋白,分离纯化该融合蛋白后,作为免疫原免疫家兔制备多克隆抗体.成功构建了pGEX-4T-1-GGPPS原核表达载体,转化Rosetta菌株后可高效表达GGPPS融合蛋白,成功制备GGPPS多克隆抗体,间接ELISA法测定抗体效价为1∶32000,并且抗体具有良好特异性.成功克隆GGPPS基因并制备了特异性的兔抗人GGPPS多克隆抗体,为进一步研究GGPPS的功能奠定了基础.     

AK078438基因原核表达载体构建、多克隆抗体制备

AK078438基因是一个功能未知的新基因.通过RT-PCR方法扩增出AK078438基因的全长开放阅读框,构建了AK078438基因的原核表达载体.经诱导表达,亲和层析纯化该基因的融合蛋白并制备多克隆抗体.ELISA和Western blot结果表明我们成功的制备了AK078438基因的抗体,为后续该基因功能的研究做好了准备.     

拟南芥转录因子TDF1的原核表达及多克隆抗体制备

在拟南芥花药发育过程中,MYB家族转录因子TDF1在调控绒毡层发育及后期功能上起到关键的作用．利用PCR方法扩增TDF1基因并克隆到原核表达载体pET-32a．将表达载体TDF1-pET32a转入大肠杆菌BL21（DE3）,用IPTG成功诱导表达了分子量约为56KD的TDF1融合蛋白．该融合蛋白主要以包涵体形式存在,分离出包涵体后进行可溶性处理作为抗原免疫家兔．制备出的多克隆抗血清经ELISA测定效价为1：2560,Westernblot检测表明该抗血清与TDF1融合蛋白识别良好．TDF1抗体的制备有助于进一步从生化水平上研究TDF1在花药发育中的功能．     

三聚氰胺多克隆抗体的制备及鉴定

用三聚氰胺偶联蛋白为抗原,按不同的时间规律及抗原剂量对成年兔进行免疫,获得特异性的三聚氰胺多克隆抗体.效价检验应用蛋白质电泳和间接ELISA方法.应用10%及12.5% SDS-PAGE,验证血清中IgG抗体的产生情况,再用间接酶联免疫吸附试验测得第4次免疫后抗体效价达到1.2×107.此法易于实施,且获得的血清样品具有较高的效价,为今后三聚氰胺多克隆抗体的分离纯化提供了可靠的实验依据.     

谷胱甘肽转硫酶多克隆抗体的制备及应用

将含有谷胱甘肽转硫酶 ( GST)基因的 p GEX质粒转入大肠杆菌 TG1后 ,在 0 .5 mmol/L异丙基硫代 - β- D-半乳糖苷 ( IPTG)诱导培养下表达了 GST,用亲和纯化得到的 GST免疫新西兰大白兔 ,获得了滴度 ( ELISA)在 2× 1 0 5以上的抗血清 ,纯化后的抗体已成功地应用于两种新的融合蛋白 GST- FLP和 GST- Pre S1的免疫印迹检测和亲和层析法纯化     

盘基网柄菌allC的克隆、表达和多克隆抗体的制备

运用RT-PCR技术从盘基网柄菌(Dictyostelium discoideum)总mRNA中克隆到了尿囊酸酶基因(allC),该基因编码区开放读框长1 100bp,编码的蛋白约42kD.由于是在野生型和突变型细胞中差异表达的片段,表明该基因在盘基网柄菌多细胞发育中起到重要作用,因此将allC克隆入融合表达载体pET-32a(+),在大肠杆菌E.coliBL21(DE3)中进行诱导表达带有6个组氨酸标签的尿囊酸酶(ALC)融合蛋白,经镍柱亲和层析,获得了电泳纯蛋白.用纯化的融合蛋白免疫新西兰大白兔,制备多克隆抗体.ELISA测得制备的抗ALC蛋白的多克隆抗体的效价可达1∶64 000,Western Blotting检测证明该抗体有较强的针对ALC蛋白的专一性.这些数据表明重组质粒表达的ALC融合蛋白具有良好的抗原性,制备ALC的多克隆抗体有良好特异性和效价,能够满足针对ALC免疫印迹和细胞内定位检测等实验要求,为深入研究ALC蛋白在盘基网柄菌多细胞发育的功能作用提供了有力工具.     

一种免疫小鼠制备大量多克隆抗体的新方法

研究了一种用纯抗原免疫小鼠,在抗体产生时注射腹水癌细胞,最后取其腹水(含抗体)的多克隆抗体制备方法,免疫1只小鼠共需免疫抗原60～300μg,可获得15～30mL腹水抗体.此法既适合于大分子质量抗原,也适合于小分子质量抗原.用ELISA、免疫印迹、免疫滴定等方法检测抗体效价、特异性、结合力等,均得到满意的结果.此种抗体在-20或-70℃最少能保持稳定1a以上.     

抗丁草胺多克隆抗体的制备及应用

以牛血清白蛋白-丁草胺免疫抗原免疫家兔获得了抗丁草胺多克隆抗体,并建立了竞争酶联免疫吸附检测丁草胺(除草剂中的一种主要成分)分析方法。该方法的检测范围在1×10^-9～100×10^-9mg/mL之间,且和化学结构相似的甲草胺和乙草胺无交叉反应。该方法也可用于检测稻田水样中丁草胺的含量。     

基于AhsA蛋白的嗜水气单胞菌特异性抗体的制备与鉴定

选取嗜水气单胞菌表面特异性抗原蛋白AhsA,构建了pET-28a(+)-AhsA表达载体,并在大肠杆菌BL21中进行表达,利用Ni-NTA亲和层析、凝胶过滤层析等蛋白纯化方法进行纯化。重组蛋白表达效果较好,浓度可达10 mg·mL^-1,纯度可达90%以上,符合制备多克隆抗体的免疫原标准。利用Western Blot技术将AhsA抗体特定识别免疫原蛋白,结果表明该抗体能够特异性识别免疫原蛋白AhsA,而对于牛血清蛋白却不能发生免疫应答,表明该抗体具有一定的特异性且AhsA蛋白具有很好的免疫原性。同时通过检测验证了AhsA蛋白抗体能够特异性检测嗜水气单胞菌,将为水产品质量控制及临床检测嗜水气单胞菌可提供新的技术。     

吗啡人工抗原的合成及多克隆抗体的制备

利用化学法合成吗啡人工抗原,将此抗原免疫新西兰大白兔制备抗吗啡多克隆抗体.利用混合酸酐法将吗啡人工抗原分别与蛋白质载体BSA及OVA偶联,经蛋白质电泳以及紫外扫描检测,证明吗啡人工抗原合成成功.用间酶联免疫检测法检测,证明制备得到了高效价的吗啡多克隆抗体血清,且与吗啡人工抗原具有高特异性反应,可用于吗啡免疫学检测方法的研究.     

重组人VEGF165蛋白在毕赤酵母中高效表达与多克隆抗体的制备

构建pPIC9K-VEGF165分泌型载体,线性化后电击转化至GS115(his4)中,经最小葡萄糖培养基(MD平板)筛选出阳性表达菌株并进行聚合酶链式反应(PCR)验证.菌株发酵上清液经Sephadex G-25,Heparin Sepharose FF和Sephacryl S-100层析介质分离纯化,目的蛋白纯度达到95%,相对分子质量约为24ku.结果表明:重组人VEGF165蛋白能诱导人脐静脉内皮细胞(HUVEC)增殖,提高HUVEC细胞的活性;重组人VEGF165蛋白免疫小鼠,制备多克隆抗体,间接酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测抗体效价达1:51 200.     

碘化酪蛋白多克隆抗体的制备

碘化酪蛋白（Iodinated Casein）是一种蛋白同化类激素,为甲状腺素的前驱物质,具有类似甲状腺素的生理作用．2002年被农业部第176号公告列入禁止在饲料和动物饮用水中使用的药物．     

胆酸钠多克隆抗体的制备及其快速检测方法研究

目的:探索用胶体金免疫层析法快速检测胆酸钠含量。方法:用碳二亚胺法合成的免疫抗原胆酸钠-BSA,免疫新西兰白兔,制备抗胆酸钠多克隆抗体。用酶联免疫吸附法(ELISA)鉴定特异性抗体效价。制备胆酸钠—OVA抗原—胶体金复合物,组装检测试纸。结果:胆酸钠抗体的效价为1∶80 000,建立的胶体金快速测定法对胆酸钠的检测限为12μg/mL。结论:试纸条法是快速检测胆汁酸含量的有效方式,在临床检测方面具有广阔的运用前景。     

用多克隆抗体检测干扰素调节因子7的表达

干扰素调节因子7(IRF-7)是调节Ⅰ型干扰素依赖型先天免疫反应的关键因子,在真核细胞防御反应中发挥重要作用。本文在大肠杆菌中表达了重组IRF-7,利用亲和层析的方法进行了纯化,并制备了鼠抗IRF-7的多克隆抗体。所得到的抗血清能够在稀释27 000倍后成功用于免疫印迹检测。该抗血清不但能识别来源于大肠杆菌的抗原,还能检测真核细胞内转染后表达的IRF-7。使用该抗体证实,转染293T细胞后表达的IRF-7主要分布在细胞质内。所制备的抗血清可用于IRF-7的表达和功能研究。