新型高比活力α-N-乙酰半乳糖胺酶应用于人红细胞A→O血型改造

α-N-乙酰半乳糖胺酶(α-N-acetylgalactosaminidase,αNAGA)是进行人红细胞(reblood cell,RBC)A→O血型改造的工具酶.采用PCR法从国内临床标本的脑膜脓毒性金黄杆菌中克隆出新型αNAGA基因,应用基因工程和蛋白质纯化技术获得足量高纯度的重组酶.重组酶分子量为49.6kD,专一性强,比活力高,在25℃及pH6.8条件下,1h内完全酶解1UA1型浓缩RBC(约100mL/U)需1.5mg酶,而1h内完全酶解1UA2型浓缩RBC仅需0.4mg酶.酶解后的A型RBC与抗A单克隆抗体、人源O型血清反应均不凝集,与A,B,O,AB等各型血清的主侧配血实验成功,主要稀有血型不变.流式细胞仪检测结果表明,酶解后A抗原和A1抗原消失,H抗原增加,证明A→O血型改造成功获得的酶解通用型RBC可以安全输给A,B,O,AB等各型受血者,不会因ABO血型不合发生输血反应.脑膜脓毒性金黄杆菌来源的αNAGA是十分理想的A→O血型改造的工具酶,具有良好的应用前景,对于提高输血安全性、消除血液偏型、节约输血成本、增强应急输血保障能力具有重要意义.     

人造血液

卡尔·兰斯泰纳(Karl.landsteiner)于1901年发现了人类血型抗原,并把人类血液分为A、B、O和AB型,从而开创了现代输血的新纪元。血型的研究,对认识迄今输血失败的原因起到了至关重要的作用。     

用基因重组α-半乳糖苷酶进行B→O血型改造

α-半乳糖苷酶是进行B→O血型改造的工具酶. 采用RT-PCR方法, 从中国海南Catimor咖啡豆中克隆了全长1.1 kb的α-半乳糖苷酶cDNA, 并构建了其表达载体. 电穿孔法将载体导入毕赤酵母GS115细胞, 筛选出重组(-半乳糖苷酶菌株. 离子交换层析纯化出α-半乳糖苷酶, 酶比活性从15 U/mg 提高到28.14 U/mg. 进一步鉴定了酶的生物化学性质, 其Km = 0.275, Vmax = 0.014 mmol@L-1@min-1. 据此确定了B→O血型改造的条件: pH 5.5~5.6, 每毫升红细胞使用100 U α-半乳糖苷酶, 26℃, 4 h. 经动物输血实验初步证明, 酶解反应后的通用O型血(enzymatically converted group O red blood cells, ECORBC)是安全的.     

用基因重组α-半乳糖苷酶进行B→O血型改造

α-半乳糖苷酶是进行B→O血型改造的工具酶. 采用RT-PCR方法, 从中国海南Catimor咖啡豆中克隆了全长1.1 kb的α-半乳糖苷酶cDNA, 并构建了其表达载体. 电穿孔法将载体导入毕赤酵母GS115细胞, 筛选出重组α-半乳糖苷酶菌株. 离子交换层析纯化出α-半乳糖苷酶, 酶比活性从15 U/mg 提高到28.14 U/mg. 进一步鉴定了酶的生物化学性质, 其K_m = 0.275, V_max = 0.014 mmol·L^-1·min^-1. 据此确定了B→O血型改造的条件: pH 5.5~5.6, 每毫升红细胞使用100 U α-半乳糖苷酶, 26℃, 4 h. 经动物输血实验初步证明, 酶解反应后的通用O型血(enzymatically converted group O red blood cells, ECORBC)是安全的.     

猪血人源化改造—— 酶解清除猪红细胞α-Gal抗原

猪红细胞(pRBC)是人红细胞的理想替代品, 但pR BC表面有异种抗原——α-Gal抗原(Galα1, 3Galβ1, 4GalNAc-Ra), 人血清中含有天然存在的抗α-Gal抗原的抗体, pRBC的α-Gal抗原会引起猪→人异种输血的急性临床输血反应. 因此要消除种间的免疫排斥, 首先要清除pRBC表面的α-Gal抗原. 实验使用基因重组的大豆α-半乳糖苷酶(rSα-GalE)切除α-Gal抗原的末端α-Gal残基, 对pRBC表面的α-Gal抗原进行人源化改造. 结果表明, rSα-GalE能清除pRBC表面的α-Gal抗原, 减缓种间的急性输血反应, 经适当浓度的rSα-GalE酶解后, pRBC的结构、功能和形态均正常.