黑麦草漆酶编码基因片段的克隆与序列分析

黑麦草中木质素的结构、含量是决定其饲用品质的主要因素。漆酶是木质素生物合成中的关键酶之一,属于多铜氧化酶基因家族。根据报道的植物漆酶编码基因的氨基酸序列中铜离子结合域及N-端糖基化位点两个保守区设计4对引物,以黑麦草总DNA为模板,经PCR扩增、克隆、测序后得到3个有效序列,分别命名为Lac10-1、Lac8-1和Lac11-1。序列分析表明,3个基因片段的编码蛋白不仅含有保守的蓝铜氧化酶结合区域HAH和N-末端糖基化位点,而且分别与黄杨、黑麦草中分离的漆酶编码蛋白的氨基酸序列具有较高的同源性。因而,推断克隆到的3个基因片段是黑麦草漆酶基因家族的成员。     

拟南芥FIE基因特异片段的克隆及序列测定

根据拟南芥FIE基因的序列设计PCR引物,以拟南芥基因组DNA为模板,通过PCR反应扩增FIE基因特异性片段,扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分析,长为1633bp,与预期结果相符。将该基因片段定向克隆到pGEM-T载体上,得到重组质粒p1633,酶切鉴定及测序分析结果表明该克隆为拟南芥FIE基因特异片段,与拟南芥FIE基因比较同源性达99.8％,可以作为探针使用。     

C_3启动子克隆及荧光素酶报告基因载体构建

为克隆C_3基因启动子序列,构建C_3基因启动子荧光素酶报告基因载体,运用PCR的方法从血液中提取到的基因组DNA中获得目的基因,双酶切后连接到荧光素酶报告基因载体上,构建C_3基因启动子报告基因载体.构建的pGL3-Basic-C_3-promotor重组质粒和内参质粒SV40瞬时转染Hela细胞,检测荧光素酶活性.结果表明,PCR扩增出C_3基因启动子片段;双酶切及测序鉴定重组体构建正确;转染Hela细胞后经双荧光素酶报告基因检测确定重组体有启动子活性.成功构建了C_3启动子报告基因载体,在细胞系中进行初步活性分析得知所克隆的C_3基因调控序列包含启动子活性区域.     

番木瓜果胶裂解酶基因片段的克隆及序列分析

以4个不同成熟阶段的番木瓜果肉cDNA为模板，经RT-PCR扩增仅在第四成熟度的番木瓜果肉中得到596bp的PL基因片段，所得核苷酸序列通过Blast分析，该序列与草莓、拟南芥、芒果、葡萄等果胶裂解酶基因的相似性都较高，均在79％-82％之间．     

Src真核表达载体的构建与表达

构建酪氨酸蛋白激酶Src真核表达载体,并检测其在HEK293T细胞中的表达.根据Genebank（GI：4574718）提供的大鼠Src的cDNA序列设计特异性引物,以大鼠海马总RNA为模板,采用RT-PCR方法扩增Src的目的基因,然后克隆至真核表达载体pcDNA3.1.将筛选的阳性重组子转染入HEK293T细胞系,免疫印迹检测Src的蛋白表达水平,经限制性内切酶双酶切及测序分析,扩增的Src的cDNA成功连接入pcDNA3.1,并且序列与Genebank中一致.免疫印迹结果表明,构建的Src-pcDNA3.1可在HEK293T细胞中表达.成功构建了Src-pcDNA3.1真核表达载体,并且可在HEK293T细胞中高效表达.     

羊草(Leymus chinensis)psbD基因开放读码框(ORF)的克隆及序列分析

从羊草中提取总RNA,采用简并PCR方法,扩增出编码353个氨基酸的psbD基因开放读码框(Open read ing frame,ORF)cDNA序列,GenBank登陆号为FJ176573,并对其序列进行了分析.同时次基因组DNA为模板对psbD基因开放读码框区域进行了扩增,证明该基因无内含子,为其功能的进一步研究提供基因材料和理论依据.     

果蝇血液发育标记基因mrj的多克隆抗体制备及检测

mrj是黑腹果蝇中一个蛋白编码基因.根据已报道的mrj基因序列,利用生物信息学分析选取果蝇mrj基因抗原亲水区,通过PCR扩增出其部分编码区序列,将其连接到pET-28a原核表达载体上.经酶切及测序鉴定质粒构建成功后,将重组质粒(pET-28a-mrj)转入Rosetta菌后通过IPTG(Isopropy1β-D-thiogalactoside)诱导表达出带His标签的重组融合蛋白后用镍柱纯化.将纯化的蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,并用Western Blot检测抗体的效价和特异性.     

SOE-PCR技术在洛伐他汀九酮合成酶基因克隆中的应用

为了验证SOE-PCK技术在洛伐他汀九酮合成酶基因(LOVB)克隆中的应用,以土曲霉基因组DNA为模板,设计4对引物,分别扩增LOVB的4个外显子,并按一定的顺序,利用SOE-PCK技术将其一一串联起来,形成LOVB①-④的cDNA序列.结果表明:重叠延伸PCP成功扩增出了LOVB①-④的cDNA序列,大小1.3 kb左右,测序结果和NCBI中登录号为AF151722.1的洛伐他汀九酮合成酶基因LOVB①-④的cDNA序列比对,同源性为98.5%.     

郁金香ACC氧化酶基因RNAi表达载体的构建

为了构建郁金香ACC氧化酶基因的RNAi表达载体.采用Trizol法提取了郁金香花瓣总RNA,根据郁金香ACC氧化酶基因编码区序列,设计了带有限制性内切酶位点的特异性引物,成功地扩增得到了郁金香ACO基因保守片段.将此片段以正向和反向插入到中间载体pBSin内含子的两端,构建成发卡结构的RNA片段,利用pCAMBIA35S-1301作为桥梁载体,构建了带发卡结构的RNAi表达载体pCAMBIA-ACO.     

甜菜M14品系特异表达基因BvM14-MADSbox启动子的克隆及序列分析

甜菜M14品系是带有白花甜菜染色体的栽培甜菜单体附加系,其染色体组成中除了包含18条栽培甜菜染色体外,还附加有白花甜菜第9号染色体,具有无融合生殖特性,无融合生殖能够固定杂种优势.在前期工作中,通过SSH、RACE等技术获得了甜菜M14品系特异表达基因BvM14-MADSbox的eDNA全长.通过6种限制性内切酶分别酶切M14品系基因组总DNA,再与相应接头连接,构建了6个DNA步移文库.根据基因BvM14-MADSbox cDNA序列设计引物,通过染色体步移技术克隆出该基因的上游DNA序列.经生物信息学分析,推测获得了BvM14-MADSbox基因上游1 718 bp的启动子序列,该序列含有启动子的基本元件TATA-box、CCAAT-box,和ARE、ERE、HSE、ABRE、CGTCA-motif等重要的顺式调控元件及一些光反应相关元件.该结果为今后BvM14-MADSbox基因的时空特异性表达调控机制奠定基础.     

联合用药对乙肝病毒标志物的影响

用特异性抗乙肝免疫核糖核酸（抗ＨＢ－ｉＲＮＡ）联合阿昔洛韦（ＡＣＶ）治疗慢性乙型肝炎１１３例,观察对乙肝病毒（ＨＢＶ）标志的影响,其结果表明：抗ＨＢ－ｉＲＮ联合ＡＣＶ对抑制或中和ＨＢＶ有一定作用。     

血液筛查中核酸检测与ELISA联合应用的研究

通过对血浆标本的核酸和血清学检测结果进行比较分析,探讨核酸检测（NAT）与酶联免疫吸附试验（ELISA）联合应用在血液筛查中的意义.研究从血浆样本中同时提取HBV、HIV和HCV核酸,采用荧光实时聚合酶链反应（PCR）进行检测,同步进行ELISA检测HBV、HIV和HCV抗原或抗体.在5 184份血浆标本中检测出HBV“窗口期”标本12份,检出率为0.23％;检测出HCV“窗口期”标本3份,检出率为0.058％;未检测出HIV“窗口期”标本.从而得出结论,核酸检测可以有效检测出血浆中的HBV、HIV和HCV的“窗口期”标本.     

血清GPI、CRP在活动期类风湿关节炎中的诊断意义

探讨葡萄糖6磷酸异构酶(GPI)、C反应蛋白(CRP)在类风湿关节炎(RA)中的临床意义.研究采用酶联免疫方法检测人血清中的GPI浓度,用散射比浊法测血清CRP浓度.结果显示RA患者GPI、CRP水平分别为(2.05±1.85)mg/L、(25.3±8.24)mg/dL,GPI、CRP阳性率分别为64.29%、71.4...     

RAPD技术在蜘蛛遗传多样性研究中的方法探讨

进行了RAPD技术在蜘蛛遗传多样性研究中的方法探讨.利用蜘蛛的附肢作为其基因组DNA抽提的材料,且该改进的方法所抽提的蜘蛛基因组DNA的产量与纯度足以满足RAPD分析的要求;通过优化RAPD PCR反应条件,可以获得清晰度高,重复性好的RAPD图谱以用于蜘蛛(如拟水狼蛛Piratasubpraticus)、拟环玟豹蛛(Par dosapseudoannulata)、武昌獾蛛Trochosawuchangensis等)的遗传多样性研究;在不投食饲养武昌獾蛛一个月以上的前提下,用随机引物S92(5′CAGCTCACGA3′)比较分析了武昌獾蛛的头胸部与其附肢各自的RAPD图谱的差异,差异不显著(P>0.05).结果表明:蜘蛛的附肢和头胸部均可作为其遗传多样性研究材料,但以前者为材料可以有效防止异源DNA的干扰.因而,其基因组DNA在作为蜘蛛遗传多样性的RAPD分析模板时要优于头胸部.     

金匮肾气丸血清样品预处理方法的研究

采用6%高氯酸沉淀蛋白、甲醇沉淀蛋白、乙酸乙脂萃取、SPE固相萃取等方法,通过比较空白血清和含药血清中的入血成分,确定金匮肾气丸血清样品最佳预处理方法并确定最佳的采血时间。发现在大鼠灌服金匮肾气丸甲醇提取物1 h后采血分离血清,采用6%高氯酸沉淀法制得的血清样品中被检测出的入血成分峰最多,分离效果好,富集程度最高,是一种简便,快捷,高检出率的方法。     

头孢他啶与牛血清白蛋白结合的光谱法研究

用荧光光谱法、紫外-可见吸收光谱法和傅立叶红外光谱法研究了牛血清白蛋白与头孢他啶间的相互作用机制.结果表明:在人体生理条件下头孢他啶可使牛血清白蛋白的荧光强度显著降低,二者在不同温度下的结合常数分别为KLB=1.399×106(24℃),KLB=7.501×105(37℃).头孢他啶与牛血清白蛋白主要以疏水作用力和氢键相结合而非单一作用力,为探讨药物头孢他啶在生物体内与蛋白质的作用机理和生物学效应提供了理论依据.     

冬眠状态乌龟尿液的生物学特性及生化分析

解剖冬眠及冬眠后禁食期间的乌龟，发现其腹腔内有一巨型储满尿液的膀胱泡．用荧光、紫外、全自动生化分析和液相色谱进一步分析冬眠乌龟体液和尿液中的生化成分，发现了一些与长寿密切相关的特点：1、具有独特的抗氧化特性：冬眠状态乌龟尿液在体外十几个小时内有抗氧化功效；冬眠乌龟尿液中脂过氧化物水平和老年色素类代谢垃圾物质水平都很低，2、冬眠乌龟尿液和血清中都含有多种有特殊功效的生物酶类和抗氧化物质：例如，血清中乳酸脱氢酶和肌酸激酶含量特别高，分别达2321mol／L和4524mol／L；抗氧化剂尿酸在血清中浓度较低，而在尿液中浓度大大提高，3、与正常乌龟相比，冬眠状态乌龟尿液中游离氨基酸成分发生了较大的变化，这些结果对于乌龟的长寿和耐应激生理机制提供了一些初步的生化解释。     

配合物[Cu(phen)(BIP)](ClO_4)_2与CT-DNA的相互作用

用紫外-可见吸收光谱、荧光光谱、粘度法和循环伏安法等方法研究了铜(Ⅱ)配合物[Cu(phen)(BIP)](ClO_4)_2(phen = 1,10-邻菲咯啉;BIP = 2-(3′,4′-亚甲二氧基苯基咪唑并[4,5-f]-1,10-邻菲咯啉)]与小牛胸腺DNA (CT-DNA) 的相互作用.结果表明:配合物与DNA的作用模式为插入方式,与DNA的键合常数为1.06×10~5 L·mol~(-1).     

花粉管通道法转柱头外露棉DNA及转化体RAPD分析

提取“异9-3”柱头外露棉总基因组DNA，通过花粉管通道法经微量注射导入抗虫棉707．1的胚囊内，D1代田间筛选到柱头外露的转化植株，遗传分析结果表明转化株柱头外露性状由一对隐性基因控制，50个随机引物进行PCR扩增，33个引物扩增出的DNA在供体、受体和转化体之间呈现出多态性，其中引物S462(TCG GCA CGC A)在供体和转化体之间出现相同产物而受体没有出现扩增产物，该引物有可能作为柱头外露系的分子标记．RAPD分析结果表明转化体与受体有较多相同基因位点，而与供体相同基因位点较少，转化体还有供体和受体都不具有的基因位点，这可能是外源DNA导入时引起碱基突变所致。     

血清型IgA在胃肠道肿瘤淋巴结转移中的表达及意义

探讨血液中血清型 Ig A含量的变化与胃肠道肿瘤是否合并有淋巴结转移的关系 .选取胃肠肿瘤合并有淋巴结转移及不合并有淋巴结转移的病例共 6 2例 ,进行术前血清 Ig A含量的测定并进行比较 .结果表明术前胃肠道肿瘤合并有淋巴结转移组的血清 Ig A含量高于不合并有淋巴结转移组的血清 Ig A含量 ,经过统计学处理 ,差异有显著性 ( t=2 .939,P<0 .0 5) .通过实验可以得出这样的结论 :术前胃肠道肿瘤患者血清 Ig A含量增高可以提示该患者已合并有淋巴结转移