贵州山核桃ISSR-PCR反应体系建立及优化

为建立贵州山核桃ISSR-PCR最佳反应体系,采用单因素试验的方法,对影响ISSR-PCR反应体系的模板DNA浓度、MgCl2浓度、d NTPs浓度、Taq酶用量、引物浓度等各因素进行了研究,确立了贵州山核桃ISSR-PCR的最佳反应体系。结果显示:最优反应体系的模板DNA浓度为40ng/u L、引物浓度为0.3umol/L、Mg2+的浓度2.9mmol/L、酶浓度0.3U、d NTPs浓度0.2mmol/L,退火温度为54℃。建立该反应体系可为贵州山核桃ISSR标记开发、物种分类鉴定、遗传图谱构建等后续分析奠定基础。     

基于二硒化钼纳米球和杂交链式反应灵敏检测microRNA

利用SiO_2纳米球为模板水热法合成了二硒化钼纳米球,并以此材料为电极基底,电沉积上AuNPs后,进行交联链式反应进行信号放大,并结合过氧化物酶催化H_2O_2+HQ底液产生电化学信号高灵敏检测microRNA-21.结果表明:新方法在1.0×10~(-16)~1.0×10~(-10)mol/L的浓度范围内呈良好的线性关系,检出限为0.16fmol/L(R_(SN)=3).该传感器被成功应用于血清样品分析.     

长蛸ISSR-PCR优化反应体系的建立及优化研究

以长蛸DNA为模板,利用单因子试验分别对影响长蛸ISSR-PCR反应的DNA浓度、Taq DNA聚合酶、Mg2+、dNTPs和引物的浓度进行了优化,并通过梯度PCR确定最适退火温度,最终确定长蛸最佳反应体系和PCR扩增程序为:25μL体系,其中包括Taq DNA聚合酶1.5 U,Mg2+2 mmol/L,dNTPs 0.15 mmol/L,引物0.4μmol/L,DNA模板量约50 ng确立退火温度为52℃。利用所建立的ISSR-PCR反应体系,通过对24份野生长蛸样本的检验,获得了清晰、重复性好、多态性高的条带,研究结果对于把ISSR标记技术引入研究长蛸不同地理群体遗传多样性和遗传结构具有重要意义。     

LAMP法鉴定家鸡性别的初步研究

为建立一种利用环介导等温扩增（LAMP）技术高效快速鉴定家鸡及早期胚胎性别的反应体系,本研究以W染色体上假基因序列EE 0.6序列为模板,设计LAMP引物,对反应温度、反应时间、Mg2＋浓度、dNTP浓度等条件进行优化.结果表明,在25μL反应体系中,Mg2＋终浓度为6 mmol/L,dNTP终浓度为1.5 mmol/L,63℃反应60 min时为最佳反应体系.在该反应体系下,LAMP成功地鉴定出家鸡性别的雌雄,准确率达到100%.此方法将成为一种快速有效地鉴定家鸡早期胚胎性别的新方法,且可以在生产实践中广泛推广应用.     

日落黄分子印迹电化学传感器的研制与应用

利用分子印迹技术,以日落黄为模板分子、邻氨基酚为功能单体,采用循环伏安法在石墨电极表面电聚合形成邻氨基酚聚合膜,经电化学方法在0.5mol/L H2SO4溶液中将模板分子去除,制得具有特异识别空穴的日落黄分子印迹修饰电极,然后,采用紫外可见分光光度法和电化学法对聚合薄膜进行表征.实验表明,该分子印迹修饰电极对日落黄有较高的结合速率、特异识别能力和灵敏度,-0.010V处微分脉冲伏安法的峰电流与日落黄的浓度在1.00×10-6～1.00×10-4 mol/L范围内呈良好的线性关系,且检出限为2.00×10-7 mol/L.运用该方法测定了饮料中的日落黄,回收率为95%～108%,为饮料中日落黄的选择性分析提供新的实验方法.     

酶标板上基于竞争杂交反应的几种miRNA序列的比色检测

多种miRNA序列的同时检测对癌症的预警与早期诊断具有重要的意义。本文基于生物素标记的miRNA和靶点miRNA与酶标板上固定的寡核苷酸探针之间的竞争反应,通过比色法来定量检测三种与胶质瘤相关的miRNA序列,即miR-182、miR-185和miR-381。通过亲和素与生物素之间的特异性相互作用,将亲和素标记的多聚辣根过氧化物酶(SA-polyHRP)衍生到微孔表面。通过检测HRP催化3,3′,5,5′-四甲基联苯胺和H2O2的显色反应来对三种靶点miRNA序列进行定量。方法最低检测浓度为10fmol/L,有望用于临床上miRNA的定量分析。碱基错配的结果表明该方法具有较好的选择性。     

观赏海棠SSR-PCR体系优化及引物筛选应用

【目的】为探究适用于观赏海棠SSR反应分子标记研究的最佳PCR反应条件,采用正交设计法对观赏海棠SSR-PCR体系进行优化,并利用优化体系筛选适于观赏海棠的多态性SSR引物。【方法】以6个二倍体观赏海棠DNA模板为材料,采用L₁₆(4⁵)正交试验对DNA模板浓度、Taq酶浓度、引物浓度、Mg²⁺浓度和dNTP浓度进行优化实验,确立了观赏海棠SSR-PCR最佳反应体系。【结果】得出15 μL优化体系各成分为:DNA模板5 mg/L、Taq酶1.25 U、引物0.3 μmol/L、Mg²⁺ 2 mmol/L、dNTP 0.25 mmol/L、1×Buffer1.5 μL。利用优化体系在73对苹果属SSR引物中筛选出15对条带清晰、多态性丰富、重复性好的SSR 引物并确定各引物的退火温度,其多态信息含量均大于0.25。【结论】正交试验结果达到优化目的,利用优化体系筛选的15对多态性引物可直接应用于观赏海棠SSR分子标记实验中,为观赏海棠品种鉴定、分类以及遗传育种等研究提供了有效工具。     

向日葵Pst Ⅰ和Mse Ⅰ内切酶组合AFLP标记体系的建立及引物筛选

 为建立并优化适合向日葵的Pst Ⅰ 和Mse Ⅰ 组合的AFLP 技术体系, 为下一步构建遗传连锁图谱及开展分子标记辅助育种奠定基础, 对向日葵基因组DNA 提取方法、酶切连接体系和选择性扩增程序的影响因素进行优化, 并对适合向日葵AFLP 分析的引物组合进行筛选。结果表明, 模板DNA 的提取采用改进CTAB 法, 酶切连接采用一步法反应14 h, 在选择性扩增体系20 μL中, Mg²⁺和dNTP 浓度分别为2 mmol/L 和0.3 mmol/L, 选扩引物的浓度为0.6 mmol/L, 预扩增产物最适稀释倍数为30 倍。同时筛选出了稳定且多态性丰富的48 对适合向日葵AFLP 分析的引物组合。     

负载零价铜的纳米多孔碳材料催化氧化罗丹明B的研究

以铜基MOF (HKUST-1, [Cu₃(BTC)₂], BTC为1,3,5-苯三甲酸)为模板, 利用一步碳化法制备负载零价铜的纳米多孔碳材料NPC@Cu。以此 NPC@Cu为催化剂, 活化过一硫酸氢钾(PMS), 在常温常压下异相催化氧化处理模拟的偶氮染料废水。采用电子显微镜(SEM)、X射线衍射(XRD)和X射线光电子能谱(XPS)等技术对催化剂进行表征, 并研究反应过程中催化剂投加量、氧化剂投加量和初始pH值对降解效率的影响。实验结果表明, 在催化剂用量为0.1 g/L, PMS浓度为2.00 mmol/L, pH值为7的条件下, 反应进行45分钟后, 浓度为0.10 mmol/L的RhB降解率可达到 100%。通过自由基捕捉实验, 证明体系中存在SO₄^–·和·OH两种自由基,表明NPC@Cu是一种性能良好的催化材料。     

非洲猪瘟病毒TaqMan探针实时荧光定量PCR检测方法的建立

为建立一种快速、准确、特异的非洲猪瘟病毒（African Swine Fever Virus,ASFV）定量检测方法,根据TaqMan探针荧光定量分析原理,对ASFV核酸进行了实时荧光定量PCR分析．借助计算机软件辅助,对ASFV基因序列及检测引物和探针进行了优化筛选,利用pET-ASFVP72质粒作为参比模板对PCR反应的Mg^2-、引物、探针浓度等参数进行了优化,其最佳浓度分别为4．5mmol／L,400nmol／L和500nmol／L．同时,对灵敏度、特异性、定量线性关系、精确度等进行了评估,最低检出量为10^2个拷贝数的质粒,特异性为100％,CT（Cycle Threshold）值的变异系数CV小于5％．对送检的15份（是否感染ASFV不确定）猪肉样品进行检测,结果全为阴性．试验表明,所建立的实时荧光定量PCR检测方法能够快速、准确、特异、灵敏地对ASFV核酸进行定量分析,从而为非洲猪瘟的检测提供了一个新的、可靠的方法．     

莱克多巴胺新型分子印迹纳米管膜的研究及应用

摘要:选取了甲基丙烯酸（MAA）作为功能单体，莱克多巴胺与MAA的比例为1:6. 本实验建立了基于表面引发原子转移自由基聚合 (ATRP), 在阳极氧化铝 (AAO) 膜上合成莱克多巴胺印迹聚合物纳米管膜的方法. 利用扫描电子显微镜 (SEM) 对MIP纳米管膜的形态进行表征, 结果显示, 在AAO表面成功修饰了MIP纳米管膜. 经过一系列的吸附实验, MIP纳米管膜, 相比NIP纳米管膜, 对莱克多巴胺及其类似物有更高的吸附容量和更好的选择性. 本实验建立了MIP纳米管膜萃取与HPLC联用, 针对β2-肾上腺素受体激动剂检测的方法. 莱克多巴胺（RAC）的线性范围是10-1000 μg/L, 克伦特罗（CLEN）、肾上腺素（EP）和多巴胺（DA）的线性范围为100-1000 μg/L, 特布他林（TER）的线性范围是200-1000 μg/L. 检出限的范围在0.074–0.25 μg/L. RSD范围是2.79-4.34%. 此方法成功应用于加标的猪肉样品中β2-肾上腺素受体激动剂的检测, 在两个浓度梯度下的加标回收率分别为86.32%-96.95%和87.84%-95.73%. RSD范围在2.67%-5.72%. 结果表明, 本实验建立的方法能对猪肉样品中β2-肾上腺素受体激动剂实现有效检测.     

CdTe/CdS量子点荧光探针测定痕量汞(Ⅱ)

在水溶液中合成巯基乙酸修饰的CdTe/CdS量子点(QDs),再基于Hg2+与CdTe/CdS量子点的荧光猝灭作用,建立用CdTe/CdS量子点作为荧光探针检测微量汞的新方法,并用该方法测定水中汞的含量。研究表明,pH值为6.24的磷酸缓冲溶液中,量子点浓度为3.75×10-4mol/L时,Hg2+离子浓度在2.3～150μg/L范围与CdTe/CdS量子点荧光猝灭强度呈良好的线性关系,相关系数为0.9985,检出限为0.87μg/L,回收率为99.0%～107.5%。该方法检测效果好,可用于实际样品分析。     

基于碳纳米笼直接修饰电极的多巴胺电化学传感器

采用模板法制备了直径约100 nm的碳纳米笼(CNCs),透射电镜表征表明制备的CNCs呈空心笼状结构.利用滴涂法将CNCs直接修饰在玻碳电极(GCE)表面,构建了多巴胺电化学传感器(CNCs/GCE).研究表明,CNCs/GCE对多巴胺的电化学氧化具有良好的催化性.最优实验条件下,CNCs/GCE对多巴胺检测的线性范围是8×10~(-8)~2×10~(-4)mol/L,检出限为6×10~(-9)mol/L(S/N=3).结果表明,该多巴胺电化学传感器具有良好的稳定性、重现性和选择性,用于实际样品多巴胺注射液中多巴胺含量的测定,结果令人满意.     

中国鲎微卫星引物扩增圆尾鲎DNA的PCR反应体系优化

采用正交设计法,从dNTPs浓度、引物浓度、Mg2+浓度、Taq DNA聚合酶用量4个因素3个水平出发,优化设计圆尾鲎DNA的PCR反应体系(引物为中国鲎微卫星引物).并采用直观分析方法分析正交试验结果,最终建立了圆尾鲎SSR-PCR最佳反应体系:总体积20μL,Taq DNA聚合酶1.5 U、dNTPs 0.16 mmol/L、引物0.2μmol/L、Mg2+2.0 mmol/L;并通过PCR梯度实验进一步优化模板DNA质量浓度、退火温度及退火时间,获得最佳反应条件:模板DNA质量浓度为30 ng/μL,退火温度为48℃,退火时间为20～25 s.对最佳反应体系和反应条件进行了检验,结果显示该反应体系稳定性高、重复性好.     

Luminol-H2O2化学发光体系检测铁蛋白

酸性介质中, 铁蛋白(Ferritin)催化luminol-H2O2反应并产生很强的化学发光(CL)信号.基于此, 建立了简便灵敏的化学发光检测铁蛋白的分析方法,其线性范围为0.5～10 μg/L, 检出限(3σ)为0.36 μg/L,为铁蛋白作为纳米粒子标记物并直接检测提供了一种新的途径.     

基于纳米金表面等离子体的高灵敏过氧化氢光学检测方法

在酸性2-吗啉乙磺酸介质中,建立基于纳米金表面等离子体的微量过氧化氢(H2O2)的比色检测体系,探讨裸眼检测途径下的分辨极限,提高体系稳定性并利用光谱分析精确定量H2O2浓度(c).结果表明,当c100μmol/L时,纳米金为团聚态,呈现蓝色;c120μmol/L时,纳米金为分散态,呈现红色.该方法的裸眼检测极限可分辨浓度差为20μmol/L.反应溶液的显色结果并不稳定,在反应后45 min内变化较快,c为60~100μmol/L的反应溶液也将逐渐由蓝色变为红色.溶液在570 nm处的吸光度(OD570)检测证明,反应体系在检测后3 h内仍持续变化.反应10 min后,加入适量半胱甘肽终止反应,可使反应溶液的显色结果稳定,提高体系稳定性.实验测定不同浓度H2O2反应产物的吸收光谱发现,c100μmol/L的反应孔产物在波长约550 nm处有吸收峰,且吸收强度与c成正相关.而c120μmol/L的反应产物吸收峰逐渐往短波长方向偏移,最终峰值约为540 nm.分析反应体系吸收光谱结果证明,各反应产物在630 nm和545 nm处吸光度的比值(OD630/545)与c呈良好的线性关系.实验对c为100~120μmol/L的H2O2溶液进行检测,定量浓度差为2μmol/L的H2O2溶液,降低裸眼检测途径下该方法的分辨极限,为微量样品检测提供更好的平台.     

西瓜种植物RAPD分析影响因子的研究

以西瓜种内的１２个品种（系）为模板ＤＮＡ,研究了影响ＲＡＰＤ扩增效果的因素。结果表明,模板ＤＮＡ、Ｔａｑ酶、随机引物、Ｍｇ２＋浓度以及ＰＣＲ反应程序在ＲＡＰＤ分析中都具有重要的作用。根据以上因子的研究结果,建立了适合西瓜种植物的ＲＡＰＤ分析的技术体系：１０μＬ反应液中,模板１０ｎｇ／１０μＬ,引物０５μｍｏｌ／Ｌ,ＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ８３）５０ｍｍｏｌ／Ｌ,ＢＳＡ５００μｇ／ｍＬ,ＭｇＣｌ２２５ｍｍｏｌ／Ｌ,ＴａｑＤＮＡ０６Ｕ／１０μＬ,ｄＮＴＰｓ２００μｍｏｌ／Ｌ,１０％蔗糖４００和１ｍｍｏｌ／Ｌ甲酚红。     

巴马香猪CYP3A29 mRNA表达的TaqMan定量方法学建立

目的建立巴马香猪CYP3A29m RNA表达的TaqMan定量方法。方法通过RT—PCR、TA克隆等技术制备CYP3A29-pMDl8-T和β-actin—pMDl8-T实时荧光定量标准品,并以CYP3A29-pMDl8-T标准品为模板,对不同浓度Mg^2＋与探针组合的TaqMan反应体系进行筛选,TaqMan PCR方法,并对其有效性及重复性进行评价。结果筛选到的TaqMan PCR方法为：PCR总体积10μL,其中含l×Buffer、5．5mmol／L Mg^2＋、0．8mmol／L dNTPmix、0．3μmol／L上下游引物、0．2U/μL rTaq、0．1 μnoL／L探针、1μL模板,热循环条件为94℃ 5 min→40cycles（94℃15s→60℃45s→读板）。结论建立了有效测定巴马香猪CYP3A29 mRNA拷贝数浓度的TaqMan PCR方法,通过该方法分别定量CYP3A29和β-actln mRNA的拷贝数浓度,即可求出CYP3A29 mRNA的表达水平。     

RT—PCR检测草鱼呼肠孤病毒的方法研究

草鱼呼肠孤病毒（Grass carp reovirus,GCRV）为草鱼出血病的病原．本实验根据GenBank中GCRV和其他水生呼肠孤病毒毒株的第六基因片段,在其保守区设计了一对GCRV特异性引物,建立了快速检测GCRV的逆转录聚合酶链式反应（RT—PCR）方法．该PCR体系中,上下游引物的最适终浓度为120nmol／L,最适退火温度为52℃．PCR特异性试验表明：所设计的引物只能扩增GCRV的核酸,而不能扩增嗜水气单胞菌BSK-10、WSSV以及正常CIK细胞的DNA或RNA．敏感性试验表明,当GCRV的反转录模板稀释至5-7时,PCR结果还为阳性．用所建立的RT—PCR方法对5份样品进行检测,结果表明本研究建立的RT—PCR检测方法可靠且可行．     

MgAPO-5可见光光催化剂的制备及其性能研究

以拟薄水铝石、正磷酸、硫酸镁为原料,采用水热法合成了MgAPO-5分子筛.以可见光光催化降解亚甲基蓝作为模型反应,详细考察了合成条件(晶化时间、模板剂种类、晶化胶体酸度)和光催化反应条件(催化剂用量、反应液初始pH值)等因素对合成产物的理化性能及光催化性能的影响.结果表明,MgAPO-5分子筛的最佳合成条件为:以三乙胺为模板剂,晶化时间为20 h,晶化胶体的pH值为6.0;MgAPO-5分子筛降解亚甲基蓝的最佳反应条件为:催化剂用量1.25 g/L,反应液初始pH值以中性为宜.