七鳃鳗CD63的分子克隆、生物学特性及表达分析

从日本七鳃鳗和东北七鳃鳗中克隆得到了CD63基因的ORF区,预测了其编码的氨基酸序列.利用生物信息学方法进行了氨基酸序列分析并构建了进化树.实时定量PCR技术分析表明:CD63在日本七鳃鳗的心脏、肝脏、肌肉、髓、鳃、肠和卵中均有表达.其中,在卵中的表达量最高.脂多糖(LPS)体内刺激日本七鳃鳗后发现,CD63在肝脏和肌肉中的表达显著升高.本研究为进一步了解CD63分子在七鳃鳗的免疫方面的作用提供了实验依据.     

免疫相关基因在健康革胡子鲶不同组织的表达分析

应用荧光定量PCR法分析抗菌肽hepcidin、c型溶菌酶和MHCⅠ基因在健康革胡子鲶肝胰脏、脾脏、胃、肠道、肾脏、头肾、心脏、脑、鳃、鳃上器官、背部皮肤、背部肌肉和尾鳍13种组织中的表达.结果显示:3种基因在以上组织中均有表达,Hepcidin基因在脾脏中表达最高,显著高于除肾脏以外的其它组织(P0.05);c型溶菌酶基因在胃中表达量最高,与其余组织的表达差异显著(P0.05);而MHCⅠ基因在脾脏和鳃中表达量相对较高,但13种组织间的表达差异不显著(P0.05).     

大黄鱼Rab11基因的克隆与表达分析

克隆了大黄鱼小G蛋白家族中的Rab11基因,测序查明其cDNA序列全长1373 bp,其中5’非编码区为129 bp,3’非编码区为587 bp,开放阅读框为657 bp,编码218个氨基酸;其氨基酸序列与罗非鱼、斑马鱼等鱼类Rab11蛋白序列同源性在95％左右,与人类、大熊猫等物种的同源性也达到90%以上。Rab11基因在大黄鱼脾脏、鳃、肾脏、皮肤、肝脏、血液、肠、心脏和胃9个组织中均有表达,在血液、肝脏中表达量最高,在胃中表达量最低;溶藻弧菌刺激后大黄鱼肝脏、肾脏和脾脏组织中Rab11基因的表达量均明显上调,提示Rab11在大黄鱼的抗病免疫反应中有着重要的作用。     

大黄鱼Rac2基因的克隆及其抗病免疫作用分析

克隆了大黄鱼ras-related C3 botulinum toxin substrate 2(Rac2)基因(命名为lycRac2),并从本实验室大黄鱼基因组数据库中获得了lycRac2基因的全长序列。lycRac2基因全长1670.427 kb,包含7个外显子、6个内含子,其c DNA序列全长1221 bp,ORF为579 bp,编码192个氨基酸。同源性比较结果显示,从鱼类到哺乳动物,RAC2蛋白的氨基酸序列相当保守,其基因均具有7个外显子和6个内含子,但不同物种之间7个外显子和6个内含子的长度都不一致。实时定量PCR检测结果显示,lycRac2基因在肝脏、脾脏、肠、胃、肾、头肾、肌肉、皮肤、脑、鳃、心脏、血液中均有不同程度表达,其中在头肾中表达量最高,肌肉中表达量最低。大黄鱼受到LPS(脂多糖)、poly I:C、副溶血弧菌刺激后,肝脏、脾脏、头肾中lycRac2基因表达量明显上调,显示lycRac2基因参与了大黄鱼的免疫反应,其可能具有对细菌和病毒的抗病免疫作用。通过原核表达还获得lycRAC2蛋白,为进一步研究其性质和功能奠定了基础。     

番鸭HSP70的SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法的建立及其初步应用

旨在建立一种高灵敏度的番鸭热休克蛋白70(Heat shock 70, HSP 70)基因的荧光定量PCR检测技术，并以此技术检测番鸭在热应激前后HSP70基因转录表达量的变化情况。由NCBI上HSP 70基因保守序列来设计特异性引物，将试验番鸭的mRNA反转为cDNA,检验其重复性、特异性和灵敏度，利用建立的方法对热应激条件下番鸭体内各组织基因的转录变化进行检测。结果表明：本研究构建的SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法所用的引物特异性较好，与1.35×10²～1.35×10⁷ copies/μL的PCR产物之间存在着良好线性关系，方程为y=-1.96 x+18.2,相关系数为-0.983,扩增效率为226.55%;熔解温度T_m值为(84.0±1.0)℃,曲线呈特异性单一峰；该方法的灵敏度为1.35×10² copies/μL。与正常条件相比，热应激条件下番鸭血液、心脏、肝脏、脾脏、肾脏和肌肉的HSP 70基因表达水平显著升高(P<0.05)。该研究成功构建了番鸭HSP 70基...     

尼罗罗非鱼主要组织相容性复合体Ⅱβ(MHCⅡβ)基因的克隆、表达和多态性

MHCⅡβ基因在鱼类免疫反应中起重要作用。采用同源克隆和末端快速扩增(RACE)技术,克隆了尼罗罗非鱼的MHCⅡβ基因。MHCⅡβ基因含有5个外显子和4个内含子,其c DNA全长为1 142 bp,开放读码框为750 bp,编码249个氨基酸。通过同源性分析和进化树分析发现,与其他硬骨鱼类和哺乳类的相似性在30.6%~78.6%,和鲈形目的鱼类同源性最高。从25尾罗非鱼的50个开放读码框的阳性克隆中共获得10条不同的核苷酸序列,分别编码不同的氨基酸。氨基酸序列比对分析发现,多态性位点主要集中在MHCⅡβ基因的第2外显子上。通过对海豚链球菌感染后易感个体和抗病个体的PCR-SSCP电泳分析,发现电泳条带出现2~12条不同的单带,测序结果表明个体存在1~6个等位基因,暗示至少存在3个MHCⅡβ基因座。q PCR检测表明,MHCⅡβ基因在鳃、心脏、脾脏等组织高度表达,在肾脏、肌肉、脑等组织中中度表达,而在皮肤、肠、肝脏等组织中表达最弱。在攻毒后的头肾组织中,MHCⅡβ基因的表达量呈现下降-上升-下降的变化趋势,表明MHCⅡβ参与了罗非鱼的免疫反应。     

红螯光壳螯虾Hsp70基因的特征及其在热应激下的表达

从NCBI数据库中获得红螯光壳螯虾CqHsp70的cDNA全长2231 bp,可编码643个氨基酸,其中4—598aa为HSP70结构域.实时定量PCR结果表明,CqHsp70基因在红螯光壳螯虾的鳃、肝胰腺、血液中均有表达.在高温(34℃)应激过程中,红螯光壳螯虾CqHsp70基因在三个组织中的表达量呈先升高后降低的模...     

稀有鮈鲫β-肌动蛋白基因片段的克隆及其同源性分析

采用RT-PCR方法,从稀有鮈鲫肌肉组织中分离和克隆出β-肌动蛋白基因cDNA部分序列,长度为1029bp,编码343个氨基酸残基．序列分析表明,该cDNA序列与其他物种昏肌动蛋白基因同源性非常高．RT-PCR能够检出该基因在稀有鮈鲫肌肉、眼、脑、心脏、肝、肠、鳃、睥、卵巢等组织中广普表达,在胚胎不同发育时期持续恒量表达．并基于已知的鱼类β-肌动蛋白基因序列构建了进化树．     

拟穴青蟹HSP70基因的克隆与组织表达

热休克蛋白70(HSP70)是一种重要的功能蛋白.利用RACE和基因克隆等分子生物学技术,获得拟穴青蟹(Scylla paramamosain)HSP70全长cDNA序列,全长共2 189 bp,包括110 bp的5′UTR(untranslated regions)、126 bp的3′UTR和一个1 953 bp的开放阅读框(ORF).ORF可编码650个氨基酸残基,总分子质量约为71.2 ku,pI为5.38.同源蛋白的比较结果显示,拟穴青蟹HSP70序列与其他一些物种具有很高相似性,推测HSP70基因具有很高的遗传保守性,而基于HSP70氨基酸序列比对而绘制的系统树基本能够反映出各物种间的进化关系.以RT-PCR法检测雌性拟穴青蟹一些组织中的HSP70表达,结果显示各待测组织中均能扩增得到HSP70,说明HSP70在拟穴青蟹为组成型表达.其中,HSP70在卵巢中表达量最高,其次为脑神经节,推测这与HSP70作为分子伴侣的功能相关.     

澳洲宝石鲈热休克蛋白90-β基因（HSP90-β）的cDNA克隆与表达

热休克蛋白(heat shock proteins,HSPs)在鱼类的应激与免疫反应中起着重要的作用,HSP90-β是该家族的重要成员。为了探讨澳洲宝石鲈(Scortum barcoo) HSP90-β在免疫应答中的作用,本研究首次克隆得到了澳洲宝石鲈HSP90-β的全长cDNA序列。该序列长2 708 bp,其中5'UTR长86 bp,3'UTR长444 bp,ORF长2178 bp,编码725个氨基酸,相对分子质量约为83 200,具有5个HSP90家族的特征序列,没有信号肽序列和跨膜结构域,与其他鱼类HSP90-β氨基酸的序列一致性皆超过90%。正常情况下,澳洲宝石鲈HSP90-βmRNA主要在肝脏表达。而感染无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)后,其在肝组织中的表达呈先降低后增加的趋势,在脾脏、头肾和脑组织则呈先上升后下降的趋势。这些结果表明澳洲宝石鲈HSP90-β可能参与了无乳链球菌感染引发的免疫反应。     

70%彪虎防除冬小麦田禾本科杂草药效试验

近年来,山东省冬小麦田禾本科杂草种群密度呈逐年上升趋势,杂草种类较多,其中雀麦、节节麦对小麦的危害尤为突出,已成为麦田的主要杂草,常年危害严重度平均达20-30%,严重地块达到50-60%,常用化学除草剂对其防除效果也不明显。为此引进了防除麦田禾本科杂草的新型除草剂--70%彪虎WG进行药效试验。70%彪虎WG是一种新型防治小麦田禾本科杂草的超高效选择性除草剂,有效成分为:磺酰胺羰基三唑啉酮。其独创的有效成分可被杂草的根和茎叶吸收,通过抑制杂草乙酰乳酸合成酶的活性,破坏其正常的生理生化代谢而发挥杀草活性。结果表明,70%彪虎WG是一种防除冬小麦田禾本科杂草的非常理想的药剂,并且对鲁麦23号等冬小麦非常安全;并且该药剂对播娘蒿、荠菜等阔叶杂草也有很好的防治效果。山东省内建议用药时间为10月下旬-11月上中旬,推广用药量为2-3g/亩。     

在热休克反应中大白鼠肝脏HSP70表达的免疫组织化学研究

用免疫组织化学方法研究了大白鼠肝脏在４６℃热休克３０ｍｉｎ后恢复期内ＨＳＰ７０的表达定位和动态变化及不同温度处理３０ｍｉｎ、恢复１２ｈｒ后ＨＳＰ７０ 表达。     

星状共聚物C70（CH3）x（PAN）x的合成及其热解行为

通过活性的末端丁基聚丙烯腈（ＰＡＮ）与Ｃ７０在乙醚／甲苯混合溶剂中的反应，并用碘甲烷处理，制定新型星状共聚物［Ｃ７０（ＣＨ３）ｘ（ＰＡＮ）ｘ］。该聚合物在结构上存在着Ｃ７０核与多条ＰＡＮ链结合，变温傅里叶红外光谱测试结果表明：随着该聚合物热解过程进行，聚合物中腈基逐渐消失而出现共轭Ｃ＝Ｎ链，并形成芳环。另外末端丁基聚丙烯腈经Ｃ７０化学修饰后热稳定性有所提高。     

SWAP-70在小鼠正常动情周期和围植入期子宫中的表达及其调节

SWAP-70是鸟苷酸交换因子家族成员之一，是PI3K介导的酪氨酸磷酸化受体下游通路的信号分子之一. 以往的研究及我们的前期工作初步表明它在小鼠子宫和恒河猴胚胎植入位点有高表达，提示此分子可能参与了胚胎植入的调节. 为此，本研究在小鼠模型中，采用原位杂交、免疫组化和半定量RT-PCR方法，系统地研究了SWAP-70在妊娠初始期胚胎植入位点、妊娠期子宫和动情周期子宫中的表达及其受雌、孕激素的调节. 结果表明SWAP-70在植入位点有非常显著的高表达，其mRNA和蛋白分布于胚泡以及对系膜侧的腔上皮细胞和临近胚泡的子宫基质细胞，而在非植入位点表达强度很弱；在妊娠第7天和第9天的母胎界面上，滋养层巨细胞、迷走滋养层和海绵滋养层都维持较强的SWAP-70表达；正常动情周期中，SWAP-70在动情期子宫中表达明显上调；卵巢切除模型显示雌激素显著上调SWAP-70的表达，孕激素能够阻断雌激素的作用. 以上结果提示，SWAP-70可能参与胚胎植入过程中多种细胞行为的调节，如胚泡黏附、基质细胞的增殖与蜕膜化以及滋养层细胞的浸润和分化过程，同时在动情周期子宫内膜细胞功能调控中发挥一定作用.     

ZAP-70在ITAM活化中的作用

在假设ITAM两步磷酸化的基础上,建立理论模型,定性讨论了ZAP-70在ITAM活化中的作用.结果表明:TCR与MHC-pep抗原多肽的亲和力是影响免疫应答的一个重要参数,但ZAP-70对ITAM活化事件的正反馈调节会使得TCR对特异性抗原识别的敏锐性降低,当这种调节达到一定程度时,免疫应答将不再依赖抗原的特异性.进一步讨论了半活化状态的ZAP-70的作用,运用此模型还解释了ITAM的活化过程存在一个ITAM/ZAP-70的浓度阈值问题.     

缺失AtArm基因导致拟南芥耐热性下降

生物信息学数据表明,At3g09350基因编码一种受高温诱导的armadillo,beta-catenin repeat蛋白,但其生物学功能迄今不详,我们利用基因组DNA PCR、RT-PCR和Western-blotting方法,对该T-DNA插入拟南芥突变体进行了筛选,获得At3g09350基因被敲除的T2代纯合突变体,通过表型分析,我们发现,该突变体的获得耐热性明显下降,呈现热敏感表型.分子进化分析结果表明,该基因为微牛物和动物Hsp70s的核苷酸交换因子的同源物,它的缺失可能导致Hsp70s分子伴侣活性下降,进而导致拟南芥耐热性下降.     

原位杂交检测hsp70 mRNA在黑腹果蝇胚胎中的表达

利用设计合成的地高辛标记的黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)hsp70 DNA探针,整体原位杂交检测热休克反应中,hsp70 mRNA在胚胎发育各阶段的表达情况.实验发现,在正常温度下黑腹果蝇的胚胎检测不到hsp70 mRNA存在.在热激的果蝇胚胎中,可检测到hsp70 mRNA的广泛存在.hsp70 mRNA在热激的胚胎中,除早期细胞化囊胚的极细胞外,其余细胞均可检测到hsp70 mRNA的均一分布.随着胚胎发育,hsp70 mRNA仍广泛分布在各细胞中,晚期胚胎中神经细胞hsp70 mRNA比其余细胞的表达水平高,说明神经细胞具有更高的热诱导活性,在热激反应中hsp70 mRNA的表达水平更高.     

富勒烯配合物η2-C70[Ru(NO)(PPh3)]2的合成与表征

合成了新的富勒烯配合物η^2—C70[Ru(NO)(PPh3)]2，通过元素分析、红外、核磁共振以及光电子能谱等手段进行表征，并根据表征结果推测了该配合物的结构。     

水稻热激蛋白基因（HSP70）的PCR法快速分析

通过比较几个已知ＨＳＰ７０的ｃＤＮＡ顺序，用ＰＣＧＥＮＥ软件中的ＰＣＲＰＬＡＮ程序设计出一对简并引物，然后从水稻（广陆矮４号）总ＤＮＡ中扩增出ＨＳＰ７０的基因片段并将其克隆到ｐＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ载体中。在完成了对克隆的序列测定之后，用ＰＣＧＥＮＥ中有关程序对其进行同源分析，并对其他已知的ＨＳＰ７０作了一些分类及分子进化方面的探讨。     

温度、铜离子对鲤鱼血清HSP70合成的影响

为了研究温度、铜离子对鲤鱼血清热应激蛋白(HSP70)合成的影响,探讨HSP70的表达机制,以健康1龄鲤鱼(Cyprinus carpio)为受试生物,10℃下驯养,经过24 h不同温度(10℃,20℃,24℃,28℃)和系列铜离子浓度(0,10,50,100,300,500 μg/ L)暴露,采用双抗体夹心酶联免疫吸附剂检测法(enzyme-linked immunosorbnent assay,ELISA)检测鲤鱼血清HSP70合成水平,原子吸收光谱法(atomic absorption spectroscopy,AAS)检测血清铜离子含量.结果表明:20℃,24℃热冲击组鲤鱼血清HSP70合成水平高于10℃组,与10℃组相比,差异极其显著(P＜0.01);铜离子能够诱导鲤鱼血清HSP70表达,呈现明显的剂量效应关系,热冲击与铜离子具有联合效应.