拟穴青蟹HSP70基因的克隆与组织表达

热休克蛋白70(HSP70)是一种重要的功能蛋白.利用RACE和基因克隆等分子生物学技术,获得拟穴青蟹(Scylla paramamosain)HSP70全长cDNA序列,全长共2 189 bp,包括110 bp的5′UTR(untranslated regions)、126 bp的3′UTR和一个1 953 bp的开放阅读框(ORF).ORF可编码650个氨基酸残基,总分子质量约为71.2 ku,pI为5.38.同源蛋白的比较结果显示,拟穴青蟹HSP70序列与其他一些物种具有很高相似性,推测HSP70基因具有很高的遗传保守性,而基于HSP70氨基酸序列比对而绘制的系统树基本能够反映出各物种间的进化关系.以RT-PCR法检测雌性拟穴青蟹一些组织中的HSP70表达,结果显示各待测组织中均能扩增得到HSP70,说明HSP70在拟穴青蟹为组成型表达.其中,HSP70在卵巢中表达量最高,其次为脑神经节,推测这与HSP70作为分子伴侣的功能相关.     

HSP70在肺癌组织中表达水平的研究

采用免疫组织化学ＳＡＢＣ法检测３９例肺部组织中ＨＳＰ７０的表达。结果显示：ＨＳＰ７０在高度分化的肺鳞癌和肺腺癌细胞中的阳性表达率与癌旁正常肺组织之间具有高度显著性差异（Ｐ〈０．０１）,ＨＳＰ７０的表达在高分化的肺鳞癌与肺腺癌之间则无显著性差异（Ｐ〉０．０５）,在低分化的肺鳞癌和肺腺癌组织中,ＨＳＰ７０呈阴性反应,ＨＳＰ７０在肺癌组织中表达水平的高低与肺癌细胞的分化程度密切相关,而与肺癌的组织学类型     

九龙牦牛CAST基因部分序列的克隆及其表达差异研究

根据牛钙蛋白酶抑制蛋白（Calpastatin, CAST） 设计并合成一对引物,从九龙牦牛肌肉组织提取总RNA,利用RT-PCR扩增获得九龙牦牛CAST基因部分片段,利用SQRT-PCR技术检测九龙牦牛各组织中CAST mRNA的表达差异．结果,成功克隆九龙牦牛CAST部分cDNA序列485bp,获得GenBank登录号为FJ483833;用DNAman软件分析发现九龙牦牛CAST基因与普通牛的核苷酸同源性依次为99％;SQRT-PCR组织表达检测表明,CAST基因在心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、肌肉、脂肪中均表达,在心脏中表达最高,在脂肪组织中表达最低．     

番鸭HSP70的SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法的建立及其初步应用

旨在建立一种高灵敏度的番鸭热休克蛋白70(Heat shock 70, HSP 70)基因的荧光定量PCR检测技术,并以此技术检测番鸭在热应激前后HSP70基因转录表达量的变化情况。由NCBI上HSP 70基因保守序列来设计特异性引物,将试验番鸭的mRNA反转为cDNA,检验其重复性、特异性和灵敏度,利用建立的方法对热应激条件下番鸭体内各组织基因的转录变化进行检测。结果表明：本研究构建的SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法所用的引物特异性较好,与1.35×10²～1.35×10⁷ copies/μL的PCR产物之间存在着良好线性关系,方程为y=-1.96 x+18.2,相关系数为-0.983,扩增效率为226.55%;熔解温度T_m值为(84.0±1.0)℃,曲线呈特异性单一峰;该方法的灵敏度为1.35×10² copies/μL。与正常条件相比,热应激条件下番鸭血液、心脏、肝脏、脾脏、肾脏和肌肉的HSP 70基因表达水平显著升高(P<0.05)。该研究成功构建了番鸭HSP 70基...     

海带热休克蛋白70基因体外原核表达研究

在前期研究克隆得到全长海带HSP70基因的基础上,为进一步研究藻类HSP70的生物学功能,将海带HSP70基因的开放阅读框区域克隆到表达载体pEASY-E2中,并转化到大肠杆菌BL21（DE3）pLysS。将阳性重组子培养于含有AMP（100 U/mL）的LB培养基,IPTG诱导表达,SDS-PAGE电泳鉴定。经5 h诱导,其表达量达到平台期,继续培养HSP70表达量并不显著增高。5 mM IPTG诱导海带HSP70蛋白表达量高于1 mM IPTG诱导蛋白表达量。     

三株弧菌热休克蛋白70基因的克隆和序列分析

 根据GenBank中同类蛋白序列设计特异PCR引物,从2株创伤弧菌Vibrio vulnificus和1株河弧菌Vibrio fluvialis中扩增出热休克蛋 白70（heat shock protein, hsp70）基因片段。对这3个片段进行克隆、测序和分析的结果表明,3个片段长均为1 911 bp,包含完整的 hsp70 ORF,编码636个氨基酸。它们的氨基酸序列与GenBank中其它物种hsp70的氨基酸序列比较发现,2株创伤弧菌hsp70基因序列 和同种其它菌株的同源性高,达98%以上;而河弧菌的hsp70序列属首次克隆;与多种原核和真核生物的hsp70氨基酸序列一起构建 了系统进化树,结果支持传统的分类结果。     

山羊Apaf-3基因的cDNA克隆、序列分析及组织表达研究

对单胎藏山羊和多胎金堂黑山羊Apaf-3基因cDNA克隆、序列分析及组织表达特性研究.采集5只多胎金堂黑山羊和5只单胎藏山羊在发情期的卵巢、垂体等组织样,进行Apaf-3基因的cDNA克隆、序列分析,并采用定量PCR技术对其mRNA进行组织表达量研究.结果,克隆出山羊Apaf-3基因长度为1731bp编码区全长为1245bp,编码414个氨基酸.Apaf-3基因在两种山羊中序列相同,且在5种组织中的表达均无差异.同源性分析表明凋亡基因Apaf-3在动物的进化中保守性低,与山羊多羔性状的相关性需要进一步研究.     

山羊ZP3基因的cDNA克隆、序列分析及组织表达研究

对高繁金堂黑山羊和低繁藏山羊ZP3基因cDNA进行克隆、序列分析,并采用Real-time PCR技术对其在发情前期母羊卵巢组织的表达进行研究.结果表明:山羊ZP3基因编码区全长为1269bp,共编码422个氨基酸,两品种间有2处碱基差异,但未导致氨基酸的差异.山羊的ZP3基因在卵巢表达量高,与其他组织差异极显著(P＜0.01),但两个品种间差异不显著(P＞0.05).说明ZP3基因主要在卵巢中表达,但可能不是影响山羊多羔性状的主基因.     

斑马鱼3种胰蛋白酶原基因的克隆、序列分析及组织表达

 胰蛋白酶是丝氨酸蛋白酶类超家族成员之一,在动物蛋白消化中起着重要作用。为深入研究胰蛋白酶在鱼类中的蛋白结构和生理功能,利用RT-PCR和RACE方法,成功获得了斑马鱼3种胰蛋白酶原cDNA序列(zftry1a、zftry1b和zftry2)。结果表明,zftry1a和zftry1b均有242个氨基酸残基组成,其中包括15个氨基酸的信号肽和5个氨基酸(LDDDK)的激活肽。zftry2由247个氨基酸残基组成,其中包括15个氨基酸的信号肽和9个氨基酸(APLGDDDDK)的激活肽。氨基酸序列比对结果显示,三者具备胰蛋白酶原的保守结构特征,如含有催化三联体氨基酸(His-57、Asp-102和Ser-195),12个半胱氨酸,位于底物结合口袋底部Asp-189和口袋开口处的Gly-216、Gly-226等。进化树结果显示,斑马鱼zftry1a和zftry1b属于group I,为阴离子胰蛋白酶原;斑马鱼zftry2属于group II,为阳离子型胰蛋白酶原。RT-PCR结果显示,三者组织分布模式类似,且在肠中有最高表达量。这些结果为研究鱼类胰蛋白酶原的基因进化和功能以及进一步探讨鱼类消化生理的分子机制奠定了基础。     

水稻热激蛋白基因（HSP70）的PCR法快速分析

通过比较几个已知ＨＳＰ７０的ｃＤＮＡ顺序，用ＰＣＧＥＮＥ软件中的ＰＣＲＰＬＡＮ程序设计出一对简并引物，然后从水稻（广陆矮４号）总ＤＮＡ中扩增出ＨＳＰ７０的基因片段并将其克隆到ｐＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ载体中。在完成了对克隆的序列测定之后，用ＰＣＧＥＮＥ中有关程序对其进行同源分析，并对其他已知的ＨＳＰ７０作了一些分类及分子进化方面的探讨。     

肝大部切除前后热休克处理对热休克蛋白、酸性磷酸酶和碱性磷酸酶活性影响的分析

综合了磷酸酶的原位复性电泳、体视学分析、比色分析等方法分析①切除大白鼠大部分肝后的肝再生期间,②热休克处理大白鼠（４６℃、３０ｍｉｎ）恢复８ｈ,再切除大部分肝后的肝再生期间,③切除大部分肝恢复４ｈ,再热休克处理（４６℃、３０ｍｉｎ）后的肝再生期间热休克蛋白（ＨＳＣ７０／ＨＳＰ６８）、酸性磷酸酶（ＡＣＰ）和碱性磷酸酶（ＡＫＰ）动态变化的资料,从６个方面比较分析了ＨＳＣ７０／ＨＳＰ６８,ＡＣＰ和ＡＫＰ在肝再生中的相互关系及对肝再生的可能作用     

模拟失重对大鼠睾丸组织结构及AR和HSP70表达的影响

采用-30°尾部悬帛模拟失重生理效应,32只Wistar雄性大鼠随机分为7 d对照组、14 d对照组、悬吊7 d组和悬吊14 d组4组,运用HE染色和免疫组织化学染色方法,分别观察模拟失重7 d、14 d大鼠睾丸组织的组织病理学变化,同时定置对比观察了对照组、模拟失重组大鼠睾丸组织中AR和HSP70的表达和定位.结果显示,悬吊7 d和14 d的大鼠睾丸组织均出现了明显的组织病理学变化,表现为睾丸曲细精管内生精上皮细胞排列紊乱,出现不同程度的变性、坏死:悬吊14 d的大鼠睾丸的病变比悬吊7 d的更为明显.免疫组化染色结果表明,模拟失重7 d、14 d的大鼠睾丸组织中,AR表达量均极显著降低(P<0.01);而HSP70表达置均极显著升高(P<0.01).在组织间隙和间质渗出物中出现大量eHSP70.研究表明,模拟失重状态对雄性大鼠生殖器官睾丸的组织结构会造成严重的病理损伤,导致睾丸生精上皮不可逆损伤,使睾丸组织分泌表达AR的功能减退,引起HSP70的过量表达和大量释放形成eHSP70,以至造成睾丸实质的严重损伤.     

成人急性白血病淋巴细胞HSP70蛋白及mRNA的表达研究

研究热休克蛋白70(HSP70)在成人急性白血病淋巴细胞中的表达。用W estern blot法检测化疗前、后及正常人HSP70的蛋白表达,RT-PCR法检测其HSP70mRNA的表达。化疗前成人急性白血病淋巴细胞HSP70蛋白表达明显低于正常人(P<0.05);其HSP70mRNA表达的灰度值为(0.112±0.005),明显低于正常(人0.198±0.002)(P<0.05);而化疗后,成人急性白血病淋巴细胞HSP70及其mRNA(0.287±0.001)明显高于正常人(0.198±0.002)(P<0.05)。HSP70在成人急性淋巴细胞白血病淋巴细胞中高表达,对癌细胞起保护作用。     

Cloning, sequencing and expression analysis of cDNA encoding a constitutive heat shock protein 70 （HSC70） in Fenneropenaeus chinensis

The cDNA encoding hsc70 of Chinese shrimp Fenneropenaeus chinensis was cloned from hepatopancreas by RT-PCR based on its EST sequence. The full length cDNA of 2090 bp contained an open reading frame of 1956 nucleotides and partial 5‘- and 3‘-untranslated region(5‘- and 3‘-UTR). PCR amplification and sequencing analysis showed the existence of introns in the region of 1--547 bp, but they did not exist in the region of 548--2090 bp of hsc70 cDNA. When the deduced 652 amino acid sequence of HSC70 was compared with the members of HSP70 family from other organisms, the results showed 85.9% similarity with HSC71 from Oncorhynchus mykiss and HSC70 from Homo sapiens. It also exhibited 85.8% similarity with HSP70 from Mus musculu and 85.4% with HSC70 from Manduca sexta. Expression analysis showed that hsc70 mRNA was espressed constitutively in hepatopancreas, muscle, eyestalks, haemocytes, heart, ovary, intestine and gills in Fenneropenaeus chinensis. No difference could be detected on hsc70 mRNA level in muscle between heat-shocked and control animals.     

山羊KLF17基因克隆与组织表达

克隆山羊Krüppel样因子17基因(KLF17)的c DNA序列,并检测其组织表达水平,为KLF17基因的功能研究奠定基础.随机选取2~3周岁的健康简州大耳羊和藏山羊羯羊各4只,屠宰采集山羊不同组织样品(心、肝、脾、肺、肾、肌肉和皮下脂肪),提取组织总RNA,利用RT-PCR法克隆山羊KLF17基因序列,进行生物信息学分析,并利用实时荧光定量PCR(q PCR)法检测KLF17基因mRNA的表达水平.结果表明,克隆得到山羊KLF17基因c DNA序列1 450 bp,包含CDS区全长858 bp,5'UTR序列12 bp,5'UTR序列580 bp,编码285个氨基酸残基.其CDS区与牛、绵羊相比在5'端少99 bp,而在531位多出361 bp,这导致其编码区在858位提前终止.山羊蛋白序列较牛、绵羊少113个氨基酸残基.组织表达结果显示,KLF17基因在藏山羊肺中具有最高的表达水平,而在简州大耳羊皮下脂肪中具有最高的表达水平.两种山羊均在背最长肌中具有最低的KLF17表达量.这些结果表明KLF17可能在山羊脂质代谢过程中具有重要调控作用.     

日本囊对虾电压门控钠通道基因克隆与组织表达

利用基因克隆等分子生物学技术,获得日本囊对虾(Marsupenaeus ja ponicus)的电压门控钠通道(voltage-gate sodium channel,VGSC)蛋白的部分eDNA序列,获得的片段核苷酸长度为2 877 bp,可编码954个氨基酸残基,总分子质量约为108.2 ku.与同源蛋白比较结果显示,日本囊对虾的VGSC序列与其他一些物种具有较高相似性,特别是跨膜蛋白结构域具有极高的保守性.基于VGSC氨基酸序列比对绘制的系统树基本能够反映出各物种间的进化关系.以RT-PCR法检测日本囊对虾VGSC的组织表达,结果显示VGSC表达与各组织的功能有极其密切的关系.VGSC mRNA在脑神经节中表达量最高,其次为肝胰腺,说明了钠通道在神经信号传导以及调节内分泌中都起到了重要的作用.     

腹泻性贝毒在翡翠贻贝中的积累、排出及其对HSP70表达的影响

以利玛原甲藻(Prorocentrum lima)为饵料,通过室内滤食实验,考查了腹泻性贝毒(diarrheic shellfishpoisoning,DSP)在翡翠贻贝(Perna viridis)体内的累积与排出规律,分析了HSP70基因的表达与毒素累积与排出之间的关系.结果显示,翡翠贻贝暴露于产毒利玛原甲藻后,其滤食率显著下降,存在明显的剂量-效应关系.毒素积累阶段,翡翠贻贝鳃组织中DSP毒素显著增加,均明显高于对照组(P<0.05).停止染毒后,贻贝体内毒素含量显著下降.染毒后,随着毒素的累积,HSP70显著增加,并于第2天达到高峰.这些结果提示,翡翠贻贝对DSP毒素有一定的清除及耐受能力,HSP70基因的诱导表达可能是贻贝对DSP毒素胁迫的一种适应性反应,可能在贻贝抗DSP毒素中发挥重要作用.