汉坦病毒囊膜糖蛋白G2在毕赤酵母GS115中的表达及鉴定

构建了编码汉坦病毒囊膜糖蛋白G2基因的重组质粒,在毕赤酵母中表达,为汉坦病毒基因工程疫苗的研究提供实验基础。利用PCR法从含汉滩病毒76-118株M基因的M56质粒中扩增编码糖蛋白G2的基因片段,克隆入酵母分泌表达载体pPICZαA,构建重组质粒pPICZαA-G2。酶切鉴定挑取的阳性克隆,转化入GS115工程菌,在含100μg/mLZeocin的YPD培养基上筛选。挑选单菌落,PCR鉴定阳性克隆,用0.5%甲醇诱导表达,并利用SDS-PAGE及Western-Blot鉴定表达产物。序列分析表明所获得的基因片段与编码汉滩病毒76-118株囊膜糖蛋白G2的基因一致;100μg/mLZeocinYPD培养基上筛选出含pPICZαA-G2转化子,PCR鉴定为阳性克隆;SDS-PAGE可见约70kDa处有目的蛋白表达条带,经Western-Blot证实该条带为汉滩病毒囊膜糖蛋白G2。成功地构建了重组酵母表达载体pPICZαA-G2,并在毕赤酵母中初步表达成功,为今后汉坦病毒囊膜糖蛋白G2表达纯化以及基因工程疫苗的制备奠定了一定基础。     

汉滩病毒S基因0.7kb片段与M基因G2片段不同拼接方式嵌合基因原核表达产物的初步比较

比较汉滩病毒S、M基因部分片段的嵌合基因不同拼接方式表达产物的活性。构建了嵌合基因原核表达载体pGEX-4T-1-S0.7G2,并与已构建的pGEX-4T-1-G2S0.7的诱导表达产物进行了比较。结果表明,融合蛋白同时保持亲本蛋白的结合活性,且前者表达产物的结合活性始终比后者低。研究表明,嵌合基因的不同拼接方式对融合蛋白的活性可能有一定的影响。     

DLL1-ICD基因真核表达载体的构建及转染鉴定

通过克隆DLL1-ICD(Delta-like1细胞内区域)的cDNA及测序鉴定,构建pEGFP-C1-DLL-ICD真核表达载体并进行细胞转染,为研究Notch信号通路与Neuritin的关系奠定基础。首先根据小鼠全长DLL1 cDNA序列,设计DLL-ICD PCR引物,以小鼠胎脑cDNA文库为模板,利用PCR技术扩增DLL1-ICD cDNA。将扩增出的基因片段克隆至pEGFP-C1载体,进行DNA序列测定。并进一步将测序正确的pEGFP-C1-DLL1-ICD真核表达载体转染HEK293细胞。结果显示:成功克隆了DLL1-ICD的cDNA片段,测序结果与基因文库中的DLL1-ICD序列一致,并在转染真核细胞后获得了较好地表达。表明pEGFP-C1-DLL1-ICD真核表达载体构建成功,并在293细胞中成功表达了DLL1-ICD-EGFP融合蛋白。研究结果为进一步探讨Notch信号通路与神经系统疾病的分子机制奠定基础。     

人类8型疱疹病毒K1基因真核表达载体的构建

为构建人类8型疱疹病毒(Human herpesvirus 8,HHV-8)K1基因的真核表达载体,采集卡波氏肉瘤(Kaposi's sarcoma,KS)患者血清,采用柱式病毒DNA抽提试剂盒抽提血清中的病毒DNA,采用套式PCR技术检测HHV-8的特异性片断KS330233以判断是否得到了HHV-8 DNA,采用PCR技术扩增HHV8 K1基因并纯化回收,酶切、连接入真核表达载体pcDNA3.1,转化大肠杆菌DH5α,挑取阳性克隆pcDNA3.1/HHV8-K1扩增后,提取质粒,进行双酶切和DNA测序鉴定.结果显示采集了经典型KS血清3例,提取了血清HHV-8DNA,扩增了特异性片断KS330233,测序结果正确提示我们得到了HHV8 DNA,扩增了HHV8 K1基因,构建了pcDNA3.1/HHV8-K1真核表达载体,经限制性内切酶酶切鉴定及测序分析证实了其序列的正确性.由此可知:成功构建了pcDNA3.1/HHV8-K1真核表达载体,为进一步研究该基因的功能奠定良好的实验基础.     

BMP7基因真核表达载体的构建及荷瘤小鼠制备

目的克隆BMP7基因及构建BMP7基因真核表达载体,稳定转染于H22细胞系,制备荷瘤小鼠。方法应用RT-PCR技术从人胚肾细胞系293T细胞总RNA中成功扩增出1 293 bp包含BMP7基因编码区的cDNA序列,在上下游加上BamHI及HindⅢ双酶切位点后形成带酶切位点的BMP7基因,然后连入含BaraH I及HindⅢ双酶切位点的pEGFP-C1表达质粒上,构建BMP7基因的重组真核表达质粒pEGFP-C1-BMP7。脂质体介导方法转染细胞,RT-PCR、western-blot方法检测其mRNA及蛋白表达,皮下注射制备荷瘤小鼠。结果扩增的cDNA经测序比较与基因文库完全一致;BamHI及HindⅢ双酶切后,质粒形成约4.7 kb和约1.3 kb两条带,与理论计算值完全一致。注射转染BMP7基因后H22细胞小鼠瘤体明显增大。结论成功克隆BMP7基因及构建BMP7基因的真核表达载体。BMP7基因高表达可能是细胞癌变的原因之一。     

HCV包膜糖蛋白基因真核表达载体的构建及其在HepG2中的瞬时表达

通过PCR法扩增出HCV包膜糖蛋白E1-E2的全长基因片段.将测序正确的片段克隆入真核表达载体pcDNA3.1(-)中,构建HCV包膜糖蛋白基因真核表达载体.再采用脂质体法转染肝癌细胞系hepG2,利用RT - PCR、Western blot等方法对目的基因的转录与表达进行分析与鉴定.结果表明所构建的含有HCV包膜糖蛋白E1-E2基因的真核表达载体在HepG2细胞中能瞬时表达.重组真核质粒的构建及表达为下一步建立稳定转染细胞系及进一步研究HCV包膜糖蛋白的功能奠定了基础.     

人脑微血管内皮细胞ACTG1基因真核表达载体的构建及表达

为了构建人脑微血管内皮细胞ACTG1基因的真核表达载体及在HEK293细胞中的表达,本研究采用RT-PCR方法,以单增李斯特菌侵染的人脑微血管内皮细胞提取的总RNA为模板,扩增ACTG1基因片段,TA克隆后经Sal I和Eco R I双酶切、测序等鉴定重组质粒,重组质粒再经双酶切,与真核表达载体p ACGFP连接,酶切鉴定后,Lipofactamine 2000转染HEK293细胞,荧光显微镜检测绿色荧光;同时采用Western-blotting对表达产物进行了鉴定。结果表明:PCR扩增得到1128 bp的ACTG1基因片段,ACTG1-p ACGFP真核表达载体构建成功,转染24 h后,在荧光显微镜下可见绿色荧光,Western-blotting检测分析,其分子量约为68 k Da的融合蛋白,与预期的大小相符合,表明重组蛋白表达成功,本研究为单增李斯特菌与脑微血管内皮细胞c DNA文库中相互作用蛋白的筛选和鉴定奠定了基础。     

HCVC基因真核表达重组体的构建

丙型肝炎病毒是丙型肝炎的病原体,对该病毒的研究已取得了很大的进展。但是在丙型肝炎的发病机理、防治研究上仍存在着许多困难,主要原因是缺乏理想的丙型肝     

人Kai-1基因真核表达载体的构建及其体外表达

克隆人Kai-1基因,构建其真核表达载体,并在体外细胞系中进行表达验证。提取人正常肝细胞系HL7702的总RNA,通过RT-PCR其反转录为c DNA;以该c DNA为模板,通过PCR扩增出Kai-1基因的编码区,将该目的片段纯化后亚克隆入真核表达载体pc DNA3.1myc-his(-)中,利用菌落PCR及DNA测序分别对Kai-1基因编码区的大小及序列进行鉴定。将所构建的重组质粒通过脂质体瞬时转染Hela细胞,48 h后裂解细胞,利用Western blot检测有无目的蛋白的表达。测序证实所克隆的Kai-1编码区c DNA正确地插入pc DNA3.1myc-his(-)中,经Western blot检测证实其在Hela细胞中得到表达。成功克隆了人Kai-1 c DNA,构建了其真核表达载体,并在Hela细胞中得到有效表达,为进一步研究Kai-1的功能奠定了基础。     

EGFP-IgG4融合基因真核表达载体的构建及其表达

构建增强型绿色荧光蛋白（Enhanced Green Fluorescent Protein, EGFP）和IgG4基因的融合蛋白真核表达载体pMM-EGFP-IgG4/WG,转染至中华仓鼠卵巢细胞(Chinese Hamster Ovary,CHO)中成功表达,并发出绿色荧光,证明pMM-EGFP-IgG4/WG是一种良好的生产分泌型外源融合蛋白的阳性对照.     

EGFR基因C端结构域真核表达载体的构建

构建EGFR基因C端结构域的真核表达载体.应用PCR技术,从含EGFR基因C端结构域的大肠杆菌DH 5α中扩增其序列,亚克隆到真核表达载体pcDNA3.1( )中,经酶切及测序进行验证.PCR扩增片段与预期结果相符,真核表达载体构建成功,测序结果与GenBank公布的基因一致.成功地构建了EGFR基因C端两个结构域的真核表达载体.     

甜菜夜蛾核型多角体病毒vp39基因重组真核表达质粒的构建及鉴定

利用DNA重组技术，将杆状病毒极早期基因iel启动子基因克隆至重组质粒pGEM-Se39中，成功地构建了重组真核表达质粒pGEM-IE1-Se39。     

IL-21/4-IgG4融合基因的真核表达

利用新型细胞因子IL-21的变异体IL-21/4与IgG4构成融合基因IL-21/4-IgG4. 将构建好的融合基因载体poptivec- IL-21/4-IgG4转染到中华仓鼠卵巢细胞中,成功并稳定表达了IL-21/4-IgG4融合蛋白.     

CTLA4Ig真核表达质粒及穿梭质粒的构建

以表达人CTLA4Ig(hCTLA4Ig)的原核质粒为基础,采用限制性DNA内切酶,DNA连接酶等基因重组技术,构建了能表达该蛋白的真核质粒,ELISA法检出了受转染的真核细胞培养上清液中的蛋白表达.在此基础上构建了含hCTLA4Ig的穿梭质粒.     

十拷贝串联重复laGLP-1基因植物表达载体的构建及对黄瓜遗传转化的研究

天然胰高血糖素样肽-1(glucagon-like peptide-1,GLP-1)是含有30个氨基酸的短肽激素,对2型糖尿病具有特殊疗效.以本实验室克隆的长效GLP-1(long acting GLP-1,laGLP-1)基因为基础,构建了十拷贝串联重复laGLP-1的无抗生素选择标记的植物表达载体pX6-laGLP-1,采用农杆菌介导法对黄瓜自交系2M1进行转化,通过PCR及Southern杂交检测分析,最后获得了4株稳定整合十拷贝串联重复laGLP-1的转基因植株.该遗传体系的建立为研发糖尿病食疗型转基因植物或用其生产治疗糖尿病的口服药物奠定了基础.     

S1不变扩张解及S1不变G扩张解的显式构造

研究了从单连通区域Ω≌R2{∞}到酉群及其实形式的调和映射的S1不变扩张解,证明了S1-不变扩张解既是KerAQZ~一可交换的又是ImAQZ-可交换的;给出了S1不变扩张解的另一种代数构造方法,并且证明了经过旗变换得到的扩张解仍然是S1不变的.随后给出了S1不变G-扩张解的显式构造.     

汉滩病毒囊膜糖蛋白g2基因重组腺病毒的构建与表达

获得汉滩病毒G2 基因 ,构建其重组腺病毒并在HEK2 93细胞中包装表达 ,为研究汉滩病毒基因疫苗提供了实验基础。设计引物采用PCR从含汉滩病毒 \|76 1 1 8株M基因的M5 6质粒扩增出糖蛋白G2 基因片段 ,并将其克隆入腺病毒载体Adeno XviralDNA ,筛选获得重组腺病毒DNA ,转染HEK2 93细胞 ,包装、扩增后得到汉滩病毒G2 基因重组腺病毒原种 ;并在感染细胞内初步表达 ,用ELISA检测表达产物。得到了含汉滩病毒G2 基因的重组腺病毒 ,其滴度约为 1 0 10 pfu/mL ,同时在感染的HEK2 93细胞中检测到汉滩病毒糖蛋白G2 的表达。含汉滩病毒糖蛋白G2 基因重组腺病毒的成功构建 ,为研究汉滩病毒基因疫苗提供了实验基础