黄颡鱼Scp3基因全长cDNA的克隆和表达模式研究

本研究采用RT-PCR和RACE相结合的方法,从长江流域重要的经济鱼类黄颡鱼(Tachysurus fulvidraco)中克隆了与减数分裂密切相关基因Scp3的全长cDNA,并对它的序列、系统进化、组织和细胞表达模式进行了研究。克隆得到的Scp3cDNA全长为1 143bp,编码240个氨基酸;系统进化分析表明黄颡鱼Scp3蛋白与同为鲇形目(Siluriformes)的斑点叉尾鮰(Ietalurus punetatus)Scp3蛋白同源性最高;序列分析结果表明,黄颡鱼Scp3蛋白含有脊椎动物Scp3蛋白保守的卷曲螺旋结构域(Coiled coil domain)和2个保守基序(CM1和CM2);组织和细胞表达模式的研究显示Scp3基因仅表达于黄颡鱼雌雄性腺:1)在精巢中仅表达于初级精母细胞和次级精母细胞;2)在卵巢中仅在初级生长期和卵黄发生前期表达。本文首次从黄颡鱼中克隆得到Scp3全长cDNA并对其进行组织和细胞表达模式的研究,为后续研究脊椎动物生殖细胞的分化及其相互作用奠定了基础。     

大黄鱼生长激素基因的克隆与表达

采用RT-PCR方法从大黄鱼脑垂体总RNA中克隆编码生长激素基因序列,并与数据库中鱼类生长激素基因进行比较.扩增获得的生长激素基因定向克隆到表达质粒pET-22b(+),并在大肠杆菌Rosetta(DE3)中表达.表达的蛋白为可溶性蛋白,表达量占细胞总蛋白的5%.     

大熊猫核糖体蛋白S12亚基基因(rpS12)的cDNA克隆及序列分析

根据已报道的部分哺乳动物核糖体蛋白S12亚基基因(rpS12)的相关信息设计引物,运用RT-PCR技术,从大熊猫的肌肉组织总RNA中成功克隆了核糖体蛋白S12亚基基因的表达序列,对其进行了克隆、测序及分析.结果表明:大熊猫核糖体蛋白S12亚基基因的表达序列全长为422bp,开放阅读框(ORF)为399bp,编码132个氨基酸的蛋白质,该蛋白的相对分子质量为1.45×104,PI为6.81,含有1个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点,3个N-豆蔻酰化位点和一个核糖体蛋白S12 signature位点.该基因的表达序列及其编码的氨基酸序列与已报道的部分哺乳动物有很高的相似性.     

豇豆钙调蛋白cDNA的克隆及序列分析

从豇豆成熟叶片中提取总RNA,反转录合成cDNA第一链,根据钙调蛋白结构基因两端保守序列设计引物,PCR扩增豇豆钙调蛋白基因,克隆到T-easy载体上并测定了其全序列.序列分析结果表明,豇豆钙调蛋白基因由450个核苷酸组成,编码150个氨基酸.与已知的多种植物钙调蛋白基因相比有很高的相似性,核苷酸序列相似性在80%以上,编码的氨基酸序列相似性在90%以上.     

大腹圆蛛拖丝蛋白基因3'端克隆和序列分析

用PCR(Polymerase Chain Reaction)技术从大腹圆蛛主壶腹腺组织的基因组DNA和RNA中分别扩增获得编码拖丝蛋白基因的3'端基因序列,克隆PCR产物到pDrive载体,经PCR、限制性酶切筛选和序列分析后证明获得了蜘蛛拖丝蛋白基因两个克隆AvDS1和AvRS2.基因序列和氨基酸序列分析表明AvDS1和AvRS2具有拖丝蛋白基因序列和蛋白质氨基酸序列特有的结构特征,氨基酸序列中存在4个motifs-(A)n(GA)n(GFGX)n以及(GGX)n.AvDS1与基因库中已报道的蜘蛛拖丝蛋白基因序列同源性较低,而AvRS2与已经报道的Nephila clavipes拖丝蛋白基因组分-1的同源性可达91%,推测AvRS2是编码大腹圆蛛拖丝蛋白基因组分-1基因片段.比较这两个克隆的核苷酸序列和氨基酸序列,发现它们之间没有同源性.推测它们是同一基因的不同片段,或是编码大腹圆珠拖丝蛋白的两个基因组分. 明AvDS1和AvRS2具有拖丝蛋白基因序列和蛋白质氨基酸序列特有的结构特征,氨基酸序列中存在4个motifs-(A)n(GA)n(GFGX)n以及(GGX)n.AvDS1与基因库中已报道的蜘蛛拖丝蛋 基因序列同源性较低,而AvRS2与已经报道的Nephila clavipes拖丝蛋白基因组分-1的同源性可达91%,推测AvRS2是编码大腹圆蛛拖丝蛋白基因组分-1基因片段.比较这两个克隆的核苷酸序列和氨基酸序列,发现它们之间没有同源性.推测它们是同一基因的不同片段,或是编码大腹圆珠拖丝蛋白的两个基因组分. 明AvD     

At3g13600截短型蛋白的原核表达载体的构建

拟南芥基因At3g13600编码一种钙调素结合蛋白,序列分析表明,该基因cDNA序列全长1 818 bp,编码一个具有606个氨基酸残基的多肽,推测分子量为68.9 kD;在At3g13600蛋白的N端存在IQ钙调素结合构象.为了从实验上进一步研究该蛋白的钙调素结合特性,通过逆转录聚合酶链式反应( RT-PCR)扩增含...     

鲑科鱼类线粒体全基因组序列结构特征及其系统发育信息分析

为了深入开展鲑科鱼类的线粒体全基因组序列的结构特征和系统发育信息的研究,利用生物信息学的方法分析了已获得的40种鲑科鱼类的线粒体全基因组序列.通过软件Clustal X进行对比,然后用软件MEGA5.05分析DNA的序列差异,并用邻接法生成系统进化树.结果发现:1)鲑科鱼类线粒体基因组的结构和基因排列顺序和其他硬骨鱼类的相同,其全长为16 526~16 997 bp.2)从系统进化树可以看出白鲑亚科(Coregonidaeinae)位于祖先的位置,是最早出现分化的一枝,鲑亚科(Salmoninae)和茴鱼亚科(Thymallinae)亲缘关系较近,互为姐妹群.3)在所有编码基因中,序列变异程度最大的是ND2基因(47.6%),最小的是16S rRNA基因(11.0);Kimura双参数遗传距离最大的是ND2基因(0.203),最小的是12S rRNA基因(0.037).     

大黄鱼Rab11基因的克隆与表达分析

克隆了大黄鱼小G蛋白家族中的Rab11基因,测序查明其cDNA序列全长1373 bp,其中5’非编码区为129 bp,3’非编码区为587 bp,开放阅读框为657 bp,编码218个氨基酸;其氨基酸序列与罗非鱼、斑马鱼等鱼类Rab11蛋白序列同源性在95％左右,与人类、大熊猫等物种的同源性也达到90%以上。Rab11基因在大黄鱼脾脏、鳃、肾脏、皮肤、肝脏、血液、肠、心脏和胃9个组织中均有表达,在血液、肝脏中表达量最高,在胃中表达量最低;溶藻弧菌刺激后大黄鱼肝脏、肾脏和脾脏组织中Rab11基因的表达量均明显上调,提示Rab11在大黄鱼的抗病免疫反应中有着重要的作用。     

大黄鱼cyclin B1和cdc2 cDNA序列特征及组织表达分析

成熟促进因子(MPF)是诱导细胞从G2期转入M期的关键因子,在配子成熟过程中具有重要作用.MPF由周期蛋白B(cyclin B,CB)和周期蛋白依赖性蛋白激酶(CDK1,由cdc2基因编码)2个亚基组成.本研究克隆了大黄鱼(Larimichthys crocea)cyclin B1(Lc-cb1)和cdc2(Lc-cdc2)基因的cDNA序列,并分析了这2个基因mRNA的组织表达特征,为解析MPF在大黄鱼性腺发育和配子成熟的作用机理奠定基础.Lc-cb1基因全长cDNA 1 882bp,可编码397个氨基酸的蛋白;Lc-cdc2基因全长cDNA序列1 151bp,可编码303个氨基酸的蛋白.基于Lc-cb1 cDNA序列推导的氨基酸序列与6种脊椎动物的CB1氨基酸序列有较高相似性(67%~84%),并具有周期蛋白盒、毁坏盒、以及蛋白酶K位点(RRxSK)等CB预期特征.基于Lc-cdc2的cDNA序列推导的氨基酸序列也与其他6种鱼类的CDK1氨酸酸序列有较高相似性(88%~97%),并具有丝氨酸/苏氨酸激酶催化结构域、ATP结合相关的保守序列(GxGxxGxV)、周期蛋白结合相关的PSTAIRE序列等CDK1的预期特征.可见,本研究克隆获得的2条序列是Lc-cb1和Lc-cdc2 cDNA全长.实时荧光定量PCR结果显示,Lc-cb1和Lc-cdc2的2个基因mRNA表达具有相似的组织特异性,在性腺中mRNA水平均远远高于其他组织,表明Lc-cb1和Lc-cdc2是大黄鱼性腺发育相关的重要基因.     

斜带石斑鱼三丁基锡结合蛋白基因的克隆与分析

采用RT-PCR和RACE方法获得了斜带石斑鱼(Epinephelus coioides)三丁基锡结合蛋白(tributyltin-binding protein,TBT-bp)肝脏基因的cDNA全长序列.TBT-bp基因cDNA序列全长836 bp,含696 bp的开放阅读框,编码231个氨基酸.虽然编码蛋白序列与牙鲆(Paralichthys olivaceus)和底鳉(Fundulus heteroclitus)TBT-bp2序列同源性不高(分别为52%、20%),但是保守的信号肽序列结构与二级结构分析提示它们属于同一蛋白家族.系统树分析表明,此次克隆得到的斜带石斑鱼三丁基锡结合蛋白基因cDNA序列属于2型三丁基锡结合蛋白(tributyltin-binding protein type2,TBT-bp2).斜带石斑鱼TBT-bp基因cDNA全序列的获得为海水养殖鱼类中三丁基锡的去毒代谢相关分子机理研究奠定了基础,对今后进一步进行种苗育苗的研发,并以此为依据提高其人工育苗及仔鱼成活率有重要意义.