皱纹盘鲍Hdh-MMP-1基因cDNA的克隆及原核表达

利用同源克隆方法和cDNA末端快速扩增(RACE)技术,从皱纹盘鲍(Haliotis discus hannai)肌肉组织中克隆得到基质金属蛋白酶-1基因(Hdh-MMP-1)cDNA全长序列(GenBank登录号:KR537291)。结果表明,Hdh-MMP-1 cDNA全长2136 bp,其中ORF长度为1551 bp,编码区含有516个氨基酸残基,预测其分子质量为58.94 ku,理论等电点为5.99。Hdh-MMP-1具有MMPs家族典型的N-端前肽区、催化区、铰链区和C-端类血红素结合区。利用SOPMA和SWISS-MODEL软件对该基因编码蛋白质高级结构进行了预测分析。氨基酸序列相似性结果显示,Hdh-MMP-1不仅与多种生物MMP-1基因具有序列相似性,且与某些软体动物和虫类的MMP-14及MMP-19也具有序列相似性。多序列比对结果显示,Hdh-MMP-1与红螺鲍、杂色鲍、美洲牡蛎的MMP-1相似性分别为95.29%、82.35%、38.85%。随后,构建了表达载体pET28a-catMMP-1,利用大肠杆菌原核表达系统,在大肠杆菌BL21 (DE3)中成功对该蛋白质催化区进行异源表达。     

温度骤变对皱纹盘鲍与西氏鲍及其杂交群体的热休克蛋白表达影响

杂交是改良种质的有效方法,杂交后代往往具有生长率、存活率、抗逆性方面的优势.为研究杂交对鲍的耐热性的影响,以皱纹盘鲍(Haliotis discus hannai)、西氏鲍(Haliotis gigantea)以及它们的正反交F1代为研究材料,以半定量PCR为研究手段研究了在梯度温度应激下,2种热休克蛋白(HSPs)在4个群体中的表达情况.实验结果表明,在正常温度下,西氏鲍具有最高的HSPs水平;在应激条件下,皱纹盘鲍的HSPs水平呈现先上升后下降的趋势,其他3个群体的HSPs水平均随温度上升而上升;在相对高温的30℃条件下,皱纹盘鲍的HSPs水平显著低于其他3个群体.本研究的结果说明,正反交F1代明显地继承了西氏鲍的耐高温能力,表现出杂种优势或中亲优势.     

皱纹盘鲍亮氨酸氨肽酶基因cDNA克隆及表达分析

利用PCR和RACE技术从皱纹盘鲍(Haliotis discus hannai)肌肉中克隆亮氨酸氨肽酶基因cDNA序列,并对其结构进行分析。皱纹盘鲍亮氨酸氨肽酶(Haliotis discus hannai leucine aminopeptidase,Hdh-LAP)cDNA全长共3251 bp,包含5'非编码区(5'UTR)56 bp,3'非编码区(3'UTR)651 bp,开放阅读框(open reading frame,ORF)2544 bp,共编码847个氨基酸残基。多序列比对结果显示,该氨基酸序列与太平洋牡蛎(Crassostrea gigas)、霸王莲花青螺(Lottia gigantea)、囊舌虫(Saccoglossus kowalevskii)的亮氨酸氨肽酶序列相似性分别为85%、68%和61%。预测Hdh-LAP基因编码蛋白质的相对分子质量为95.09 ku,理论等电点为5.16。Hdh-LAP蛋白质的二级结构以α-螺旋和无规则卷曲为主,其中α-螺旋占38.02%,无规则卷曲占30.11%,β-折叠占22.43%,β-转角占9.45%。Hdh-LAP主要分布在细胞质(59.2%)、线粒体(10.0%)和溶酶体(10%)中,推测其可能在能量代谢和辅因子的生物合成过程中发挥信号转导和转录因子调控的作用。系统发育关系分析结果显示,Hdh-LAP与牡蛎亮氨酸氨肽酶关系最近。荧光定量PCR结果表明,Hdh-LAP基因在鲍肌肉、肝胰腺、性腺、血淋巴细胞、腮、外套膜等6个组织中均有表达,在血淋巴细胞中表达量最高,肌肉次之,性腺最少。     

青蛤丝裂原活化蛋白激酶(MAPKs)基因的克隆及其在鳗弧菌胁迫下的表达分析

采用Illumina MiSeq二代测序方法筛选得到青蛤丝裂原活化蛋白激酶(MAPK/p38)基因相似序列,进一步克隆得到全长cDNA.利用荧光定量PCR技术检测该基因在青蛤各组织中以及在鳗弧菌胁迫下的组织表达特征.结果显示,该基因全长共1781bp,开放阅读框长度为1104bp,编码367个氨基酸.在正常条件下该基因在青蛤体各组织中都表达,其中血淋巴中表达量最高,肝脏次之,鳃中最少.经菌液侵染后12h青蛤血淋巴中表达量即达到峰值,随后表达量逐渐降为正常水平.     

溶藻弧菌HY9901鞭毛蛋白flaC基因的克隆和序列分析及真核表达质粒的构建

参照GenBank上登录的副溶血弧菌鞭毛蛋白flaC基因序列设计引物,PCR扩增溶藻弧菌HY9901株的flaC全长基因,序列分析结果显示该基因为1 155 bp,编码384个氨基酸.与GenBank中其他弧菌的同源基因序列比对显示,溶藻弧菌flaC基因与副溶血弧菌flaC基因的同源性最高(87%).将该基因定向克隆到真核表达质粒pcDNA3.1(+)中,获得带溶藻弧菌鞭毛蛋白flaC基因的真核表达重组质粒pcDNA-flaC,为其DNA疫苗的进一步研究奠定了基础.     

3种鲍16S rDNA基因片段序列的初步研究

本文对引自日本的盘鲍（Haliotis discus discus)、皱纹盘鲍（H.discus hannai)和大鲍（H.gigantiea)3个自然群体的线粒体DNA 16S rRNA基因片段进行了扩增和测序，分析了528bp的碱基序列，结果显示：3种鲍的基因序列中A＋T含量为56.74%-57.12%。3个自然群体间碱基片段序列差异不显著，盘鲍与皱纹盘鲍、大鲍彼此均仅有1处核苷酸检测到变异，皆为碱基转换，同源性为99.81%；皱纹盘鲍与大鲍有2处碱基转换，同源性为99.61%。16S rRNA基因在鲍属内表现出很高的保守性。     

3种鲍16S rRNA基因片段分析及系统发育研究

运用PCR技术对皱纹盘鲍(Haliotis discus hannai)、黑足鲍(H.iris)和黑唇鲍(H.rubra)3种鲍16S rRNA基因扩增,纯化后测序。结果表明:皱纹盘鲍、黑足鲍和黑唇鲍序列长度分别为544、546、550 bp,序列AT含量分别为58.1%、56.1%和55.9%,三者序列同源性高达94.18%,碱基变异位点分别集中在9~34 bp、248~295 bp、326~375 bp。所得结果与Genebank中22种鲍相应序列进行对比分析,25种鲍遗传距离距离在0.00~0.14之间;用NJ和ML法绘制系统发育树分析其亲缘关系,结果表明鲍科系统发育呈现出一定的区域性,并且染色体数目相同的物种容易聚为一支。     

海中珍品—鲍鱼

鲍鱼(Abalone)是鲍的俗称,是些栖息在海洋中营匍匐生活的底栖贝类。隶属于动物界中的软体动物门、腹足纲、前鳃亚纲、原始腹足目、鲍科。分布在我国沿海的主要种类有:皱纹盘鲍(Haliotis dis-cus),杂色鲍(H.diversicolor),耳鲍(H.asinina),多变鲍(H.varia),羊鲍(H.ovina),格鲍(H.clathrata)等。鲍是由一个钙质的外壳和壳     

斑马鱼SAA基因克隆及表达分析

利用巢式PCR(nest PCR)的方法克隆斑马鱼血清淀粉样蛋白A基因,并进行生物信息学分析.实时荧光定量PCR结果显示:SAA在斑马鱼胚胎发育时期的表达量呈现明显的“增长—稳定—增长”趋势.成鱼组织分布中,SAA在11个斑马鱼组织中均能检测到,在心脏和肝脏中相对高表达.     

副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)FlaI基因的合成及其克隆与鉴定

根据副溶血弧菌野生型菌株BB22 FlaI基因cDNA序列,通过合理的引物设计、链延伸反应、PCR反应以及分子克隆等技术,成功地合成出编码极鞭毛蛋白的FlaI基因全长片段,并将其克隆至pMD18-T载体质粒上.序列分析和酶切鉴定显示FlaI基因得到了正确的合成和克隆.     

九孔鲍免疫防御中Ig样、补体样、CRP样物质的应答

对九孔鲍拮抗副溶血弧菌感染过程中血淋巴免疫球蛋白样物质、补体（C3、C4）样物质、C反应蛋白样物质的变化进行检测,结果表明,在拮抗副溶血弧菌感染的免疫应答中,九孔鲍血淋巴液中免疫球蛋白样物质IgG-like、IgA-like、IgM-like,补体样物质C3-like、C4-like,C反应蛋白样物质CRP-like等呈现急剧增加,尔后逐渐减少,有时甚至大量被消耗的变化特点,其变化与机体抗感染免疫应答过程及免疫原剂量存在一定的相关性.血淋巴中三类免疫球蛋白样物质和二类补体样物质含量峰值一般出现在注射感染后6-24 h,48 h后下降,有时甚至降低至本底水平,C反应蛋白样物质质量浓度在感染后12-96 h内都较高,168 h后接近本底水平.副溶血弧菌感染剂量对上述物质的表达速度和水平皆有正面影响.     

副溶血性弧菌荧光快速检验方法的研究

为了快速识别副溶血型弧菌导致的食物中毒和食品污染,本文经过试验研究采用免疫荧光原理使用荧光二抗血清在荧光显微镜下识别副溶血型弧菌荧光菌球,以期达到快速筛查副溶血弧菌污染食品目的。本方法适用于海洋水产品和淡水水产品及加工的含盐其它食品。     

4种鲍肠道菌群多样性比较

利用16S rRNA高通量测序技术比较皱纹盘鲍、黑足鲍、黑唇鲍和杂交鲍(皱纹盘鲍♀×黑足鲍♂)菌群结构特征、多样性.结果表明,OTU数量、Shannon指数和Chao1指数均为黑足鲍最大,黑唇鲍最小;4种鲍肠道中优势菌门为变形菌门(Proteobacteria)、梭杆菌门(Fusobacteria)和软壁菌门(Tenericutes),占比达到61.93％～95.78％.其中,皱纹盘鲍、黑足鲍和杂交鲍中绝对优势菌门为变形菌门,而黑唇鲍为软壁菌门;冷泥杆属(Psychrilyobacter)、弧菌属(Vibrio)和支原体属(Mycoplasma)为4种鲍肠道的优势菌属,占比达到39.70％～53.65％;4种鲍核心菌群共有175个OTU,相对丰度超过1％的共有11个OTU;Anosim和Adonis分析均发现杂交鲍与黑唇鲍、杂交鲍与黑足鲍、皱纹盘鲍与黑唇鲍肠道菌群存在显著性差异(P<0.05);经LefSe分析鉴定出4种鲍肠道菌群具有显著性差异的Biomarker共有7个,包括黑足鲍的6个和杂交鲍的1个.     

锌、铜离子对皱纹盘鲍（Haliotis discus）幼体毒性的初步研究

皱纹盘鲍(Haliotis discus hannai Ino)属腹足类软体动物。在其人工育苗中,往往环境有害因子对鲍鱼幼体有明显的毒害作用。为克服这些有害因子,以利于人工育苗工作正常进行,我们开展了锌、铜离子对皱纹盘鲍幼体毒性试验工作。浙江北部沿海与我国重要的上海经济区相邻,工业发达、人口密集,各种污水直接排放入海。因此,研究各种污染物对海洋生物的毒性影响。在水产资源环境保护上具有重要意义。各种污染物对海洋生物的毒害作用研究报导较多,但有关有害物质对皱纹盘鲍的毒性     

大黄鱼Rac2基因的克隆及其抗病免疫作用分析

克隆了大黄鱼ras-related C3 botulinum toxin substrate 2(Rac2)基因(命名为lycRac2),并从本实验室大黄鱼基因组数据库中获得了lycRac2基因的全长序列。lycRac2基因全长1670.427 kb,包含7个外显子、6个内含子,其c DNA序列全长1221 bp,ORF为579 bp,编码192个氨基酸。同源性比较结果显示,从鱼类到哺乳动物,RAC2蛋白的氨基酸序列相当保守,其基因均具有7个外显子和6个内含子,但不同物种之间7个外显子和6个内含子的长度都不一致。实时定量PCR检测结果显示,lycRac2基因在肝脏、脾脏、肠、胃、肾、头肾、肌肉、皮肤、脑、鳃、心脏、血液中均有不同程度表达,其中在头肾中表达量最高,肌肉中表达量最低。大黄鱼受到LPS(脂多糖)、poly I:C、副溶血弧菌刺激后,肝脏、脾脏、头肾中lycRac2基因表达量明显上调,显示lycRac2基因参与了大黄鱼的免疫反应,其可能具有对细菌和病毒的抗病免疫作用。通过原核表达还获得lycRAC2蛋白,为进一步研究其性质和功能奠定了基础。     

皱纹盘鲍（Haliotis discus hannai）、黑足鲍（Haliotis iris）及其杂交F1代营养成分的比较分析

利用生物化学方法,对皱纹盘鲍、黑足鲍及其杂交F1腹足部肌肉一般营养成分、氨基酸及脂肪酸组成与含量、矿物质元素及总糖和还原糖含量进行测定分析。结果表明,杂交鲍的粗蛋白含量最高（17．97％）,黑足鲍的粗脂（1％）和粗糖（9．29％）含量最高;杂交鲍氨基酸总含量（58．91％）和呈味氨基酸含量（28．77％）最高,黑足鲍的必需氨基酸含量最高（21．33％）,皱纹盘鲍氨基酸总含量、呈味氨基酸含量及必需氨基酸含量最低;黑足鲍与杂交鲍脂肪酸种类和不饱和脂肪酸含量高于皱纹盘鲍。实验共测定9种矿物质元素,除了黑足鲍腹足部肌肉Mn、Cu含量明显高于皱纹盘鲍和杂交鲍外,3种鲍其他7种矿物质元素含量差别不大;黑足鲍总糖和还原糖含量最高,皱纹盘鲍最低。以上实验结果表明,通过种间杂交,亲本某些遗传性状缺陷在子代中得以改良,并且获得的杂交F1代部分性状优于双亲,表现出一定的杂交优势。     

翘嘴红鲌热休克蛋白60的基因克隆及其表达特征分析（英文）

利用同源克隆和RACE技术克隆了翘嘴红鲌热休克蛋白HSP60 cDNA全长序列,并对HSP60基因的序列特征进行了分析。EiHSP60 cDNA序列长2 323 bp,开放阅读框为1 728 bp,编码575个氨基酸,其编码蛋白相对分子量为61.26 k D,等电点为5.27。BLAST分析结果表明EiHSP60与哺乳动物、鸟和鱼类等物种的CCT具有较高的同源性。生物信息学分析结果显示,EiHSP60蛋白序列中包含1个典型的分子伴侣蛋白60信号基序。实时荧光定量PCR检测结果显示,EiHSP60在翘嘴红鲌各个组织中均有表达,但在肝脏中的表达量为最高。使用脂多糖对翘嘴红鲌进行攻毒后,在不同时间段取其肝脏总RNA,利用实时荧光定量PCR技术进行EiHSP60 m RNA的表达水平分析。分析结果显示,经过脂多糖攻毒后翘嘴红鲌HSP60呈现时间依赖型的表达模式,且在肝脏中的表达水平呈现上调趋势。上述结果表明,EiHSP60为一种涉及免疫反应的诱导型蛋白,而高表达量的EiHSP60可能在提高翘嘴红鲌免疫反应过程中发挥重要作用。     

杂色鲍后消化道生长相关基因HdEGF1的研究

附着变态是许多海洋无脊椎动物幼体生长发育的一个必经过程,是幼体性状消失而成体性状展开的关键阶段.报道了与附着变态密切相关的杂色鲍HdEGF1基因的克隆、序列分析及其时空表达模式.运用cDNA末端快速扩增技术(RACE)克隆了HdEGF1基因全长cDNA序列.该基因全长1 239bp,含1个343个氨基酸残基的开放阅读框(ORF),推测的蛋白序列包含3个Ca2+结合类表皮生长因子(EGF-CA)结构域和1个血管性血友病因子(vWFA)结构域.通过序列相似性比较,确定其为新型表皮生长因子1(EGF1)相关蛋白.荧光定量PCR(qPCR)结果显示HdEGF1基因在幼体附着后的表达量比附着前任一时期均高19倍以上;全胚原位杂交(WMISH)结果显示HdEGF1基因集中表达在变态后幼体后消化道的表皮细胞.HdEGF1基因的这种时空表达模式表明HdEGF1受严格的时空调控,直接参与了附着后杂色鲍幼体后消化道的生长和细胞分化.推测HdEGF1蛋白与某未知的vWFA-结合蛋白一道调控着杂色鲍幼体后消化道的空间走向.因此,HdEGF1蛋白很可能在后肠的形态建成中起着非常核心的作用.本研究为贝类肠道形态建成机制的深入研究提供了切入点,HdEGF1基因可以作为重要的标志分子,用于深入研究肠道形态建成过程中的信号通路、细胞分化和细胞迁移.     

黄姑鱼NK-lysin基因的克隆及表达分析

从黄姑鱼转录组数据库中筛选出NK-lysin基因,命名为YdNkl-2。YdNkl-2基因cDNA全长600 bp,其中开放阅读框为456 bp,编码151个氨基酸。YdNkl-2具有一个信号肽和一个鞘脂激活蛋白B（saposin B）结构域。亚细胞定位结果显示,YdNkl-2分布于细胞质和细胞核。实时荧光定量PCR结果表明,YdNkl-2的mRNA广泛分布于黄姑鱼各组织,其中在鳃和脾脏中的表达量最高。经哈维氏弧菌感染后,头肾、肝脏和脾脏中的YdNkl-2表达量均明显升高,提示YdNkl-2在哈维氏弧菌感染黄姑鱼过程中发挥重要作用。     

淞江鲈HSP70基因cDNA部分序列克隆及其组织表达差异

为了研究HSP70(heat shock protein 70)是否可作为淞江鲈(Trachidermus fasciatus Heckel)养殖中的应激监测分子指标,根据鲤鱼热应激蛋白70基因序列(AYl20894)设计并合成引物,以淞江鲈肝脏组织总RNA为模板,获得淞江鲈HSP70基因cDNA部分序列,长度为480bp,GenBank登陆号为KC342053.序列分析结果显示此序列与红笛鲷(Lutjanus sanguineus)等有较高的同源性.同时,应用所获淞江鲈HSP70基因部分序列,以淞江鲈β-actin基因的序列(HM449124)为内参,利用荧光定量PCR技术,检测淞江鲈肌肉、肠、脑、皮肤、性腺、肝脏、心脏、鳃、鳍9个组织的表达差异.结果表明,HSP70在淞江鲈9个组织中普遍表达,其中在鳍中表达量最高,在性腺、鳃、脑、肌肉、肝脏、皮肤、肠中的表达量依次递减,在心脏中表达量最低.在鳍中HSP70的表达量可能成为衡量淞江鲈应激程度的指标.