人源程序性死亡配体PD-L2蛋白的原核表达与抗血清制备

利用原核表达系统获得包涵体表达形式的重组蛋白h PD-L220~123(Ig V结构域)和h PD-L220~208(Ig V结构域和Ig C结构域);将重组蛋白利用Ni-NTA柱亲和层析纯化与复性后,作为免疫原免疫Balb/c雌性小鼠制备鼠抗人的多抗血清,经ELISA法检测其效价均达到1∶106;Western-blot实验结果表明,制备的多抗血清均能特异性识别h PD-L2蛋白.以制备的多抗血清进行IHC实验评估与鉴定,结果显示:以h PD-L220~123重组蛋白为免疫原制备的多抗血清阳性较弱且定位模糊,以h PD-L220~208重组蛋白为免疫原制备的多抗血清具有很强的膜定位且背景清晰.     

Long R^3-IGF-Ⅰ的克隆表达

在重组质粒pExSecI-IGF-Ⅰ的基础上,采用基因克隆方法合成了长链人胰岛素样生长因子(Long R3-IGF-Ⅰ)基因序列,构建基于该基因的重组原核表达质粒.将重组质粒转入E.coli,并对其表达条件进行了优化.实验结果表明,在37 ℃,IPTG终浓度0.6 mmol/L,诱导3 h条件下,Long R3-IGF-Ⅰ以包涵体形式可得到高效表达.将包涵体变性溶解后通过分离纯化,目的蛋白纯度达到95%以上.通过尿素梯度透析复性法对变性包涵体复性,复性率达到66%.     

人细胞周期蛋白D1在大肠杆菌BL21中的表达及纯化

将人细胞周期蛋白D1全长cDNA克隆入原核表达载体pET-28c(+)中, 经酶切和测序鉴定正确的重组质粒转化E.coli BL21(DE3)后获得表达菌株. 该菌株经IPTG诱导高效表达出带有组氨酸标签的以包涵体形式存在的融合蛋白, 表达量占菌体总蛋白的23%. 包涵体经洗涤和溶解， 在变性条件下利用Ni²⁺螯合柱纯化、 尿素梯度复性后， 得到纯度达98%以上的纯化蛋白. SDS-PAGE显示纯化蛋白的分子量约为43 ０００， Western-b lot分析表明， 在相应分子量处有一特异性条带， 说明成功表达和纯化重组人细胞周期蛋白D1.     

丙二酸盐克罗诺杆菌PspA包涵体蛋白的表达、复性及纯化方法优化

为研究丙二酸盐克罗诺杆菌(Cronobacter malonaticus)中噬菌体休克蛋白A(phage shock protein A,PspA)的结构与功能，文章构建了PspA融合蛋白表达载体，但重组蛋白以包涵体形式大量表达；为获取较高浓度的可溶性蛋白进行后续探究，使用尿素裂解液使蛋白变性后，经多种方法复性GST-PspA包涵体蛋白，使其重新恢复生物学活性。研究结果表明，4℃低温条件下包涵体蛋白经尿素梯度稀释透析以控制复性速率，防止蛋白分子快速聚集，可以实现高效复性和纯化GST-PspA融合蛋白。为进一步探索Psp系统中各蛋白的功能及相互作用的研究提供一定的参考。     

小鼠附睾特异性辅脂酶的原核表达及其抗体的制备

目的:利用原核表达系统重组表达小鼠附睾特异性辅脂酶(meClps),并制备抗meClps抗体。方法:通过生物信息分析meClps蛋白结构,Oligo 6设计引物,PCR法从小鼠附睾cDNA中扩增meClps全长序列并克隆到pMD19-T载体中。将含meClps序列pMD19-T载体通过PCR扩增成熟肽区段序列,重组到pET-21b原核表达载体上,经菌落PCR及测序鉴定后,转化到表达菌株E.coliBL21(DE3),经IPTG诱导蛋白表达后用Tricine-SDS-PAGE和Western blotting检测重组meClps的表达。包涵体沉淀经浓度为2 mol/L尿素洗涤,Tricine-SDS-PAGE分离、染色、脱色,切下目的条带用生理盐水浸泡、磨碎与弗氏佐剂混合后免疫新西兰大白兔获取免疫血清,Western blotting检测抗体与meClps反应。结果:在原核表达系统成功重组表达meClps,目的蛋白主要以包涵体形式存在,制备了高效价的兔抗meClps抗体。结论:成功建立meClps的原核表达系统和获得兔抗meClps抗体。     

人CDK4基因的原核表达及重组蛋白的纯化和复性

将人CDK4基因克隆入原核表达载体pET28a（+）中, 经 酶切和测序鉴定正确的重组质粒pET28a-CDK4, 转化E.coliBL21(DE3)后获得表达菌株. 该表达菌株经IPTG诱导后, 高效表达出带有组氨酸标签的以包涵体形式存在的融合蛋白, 表达量占菌体总蛋白的52.6%, 包涵体经过洗涤、 尿素变性溶解、 His Trap HP Kit柱纯化、 稀释复性, 获得纯度达98%以上的蛋白. SDS-PAGE及Western blot分析表明, 在分子量34 000处有一特异性蛋白条带. 结果表明, 已成功的表达和纯化纯度达98%的重组人CDK4蛋白.     

透析法和稀释法复性重组人Cu,Zn-SOD包含体

以稀释法和透析法对在E.coli中以包含体形式表达的重组人超氧化物歧化酶(rhSOD)进行复性.以8 mol/L尿素溶解分离纯化的包含体(纯度达80%以上),对其稀释或透析至尿素终浓度为1.0 mol/L后,在稀释样品中补加终浓度50μmoL/L的Cu2+和5.0μmoL/L的Zn2+,在透析样品中补加终浓度5.0μmoL/L的Cu2+和0.5μmoL/L的Zn2+,分别获得了比活3 300 u/mg和4 300 u/mg的复性rhSOD.该复性样品经铜螯合亲和层析柱纯化可获得更高比活性的rhSOD.     

重组人胰岛素的体外复性纯化

对大肠杆菌表达的重组人胰岛素原包涵体蛋白的变性复性条件进行了优化。考察了变性液中DTT的浓度,复性液的pH值,还原型谷胱甘肽(GSH)与氧化型谷胱甘肽(GSSG)的物质的量比,甘氨酸(Gly)浓度对复性的影响。结果表明,在变性液中加入60mmol/L DTT,复性液pH9.5,GSH与GSSG物质的量比为5∶1,Gly浓度为50mmol/L条件下复性率最高。复性后的重组人胰岛素原过DEAE-Sepharose FF柱,经过TPCK-胰蛋白酶和羧肽酶B酶切后,再过Sephadex G-25柱,得到纯度较高的重组人胰岛素。目的蛋白收率为96mg/g干菌体。     

抗人PD-1高亲和力抗血清的制备及其在PD-1免疫印迹分析中的应用

利用纯化的可溶性人PD-1胞外域(sPD-1)蛋白为免疫原免疫小鼠,获得抗血清.免疫印迹显示该抗血清与原核表达的sPD-1有特异性反应,但与某些菌体蛋白存在交叉反应.经菌体蛋白吸附法处理后,交叉反应明显减弱.以商业化抗人PD-1抗体和小鼠sPD-1抗血清分析经亲和层析富集的活化的Jurkat T细胞表达的PD-1,只有自制的抗血清鉴定到特异反应条带,其表观分子质量为49 ku.     

人溶菌酶N端与Exendin-4嵌合蛋白的基因克隆及原核表达

目的:克隆嵌合多肽人溶菌酶N端-Exendin-4基因并进行原核表达和纯化.方法:通过重组PCR技术将人溶菌酶N端74个氨基酸的基因序列与Exendin-4多肽基因序列相连接,其间引入一段由凝血酶和二肽基肽酶识别位点组成的连接序列.以嵌合基因hLYZ(N74)-Ex4与质粒pET-32a(+)构建原核表达体,转化大肠杆菌BL21(DE3)并诱导表达.表达蛋白经Ni-NTA亲和层析纯化、Western blotting鉴定;透析复性后,以肠激酶切割并回收目的多肽.结果:重组质粒pET-32a/hLYZ(N74)-Ex4构建正确,目的蛋白主要以包涵体形式存在,37℃诱导4h、IPTG浓度为0.6 mmol/L时表达量最高,约占菌体蛋白总量的30%.Western blotting检测显示重组蛋白为单一清晰条带.重组蛋白经肠激酶切割后,回收得到高纯度的嵌合多肽.结论:成功构建hLYZ(N74)-Ex4嵌合基因的原核表达质粒,高效原核表达并获得高纯度目的蛋白.     

重组人干扰素α2b和胸腺肽αl融合蛋白的分离纯化

考察了大肠杆菌E.coli表达的重组人干扰素α2b和胸腺肽αl融合蛋白包涵体的变性、复性及融合蛋白的分离纯化过程。实验结果表明：包涵体经7mol/L盐酸胍,10mmol/L DTT变性;1mol/L尿素,2mmol/L还原型谷胱甘肽,0.2mmol/L氧化型谷胱甘肽脉冲加样稀释复性;金属螯合层析收集0.3mol/L咪唑洗脱峰,冷干后经重组肠激酶30℃酶切24h、Sephadex G50 柱纯化,可得到纯度达90%的重组人干扰素α2b和胸腺肽αl融合蛋白,且最终目的融合蛋白产量达68mg/g干菌体。     

人P53的原核表达及包涵体复性研究

通过检测血清中p53蛋白及其抗体变化诊断肿瘤的ELISA试剂盒的研发需要大量制备p53蛋白.本研究通过构建人野生型p53基因的原核表达质粒pET-32a-p53,在大肠杆菌中诱导表达得到p53包涵体蛋白,经包涵体变性、亲和纯化、复性得到可溶p53蛋白.发现利用8M尿素对包涵体进行变性溶解,经镍柱亲和纯化得到纯度超过95%的变性蛋白.尝试透析复性、稀释复性和柱上复性3种方法分别对p53变性蛋白进行复性.结果表明透析复性的复性率最高,这为原核表达制备p53提供了一种参考.本研究为ELISA法检测血清中p53蛋白及其抗体诊断肿瘤相关试剂盒研发奠定了基础.     

鸡传染性法式囊病毒VP2原核表达蛋白的纯化和复性

对原核表达的鸡传染性法式囊病毒(IBDV)VP2蛋白进行可溶性分析与不可溶性分析,结果表明蛋白主要以包涵体形式存在,利用溶菌酶、Triton-100、尿素等试剂进行纯化和复性后,对复性前后的蛋白分别与特异性多抗进行Dot-ELISA,复性后蛋白的反应活性增强了10倍,对复性后的蛋白与IBDV16株单抗进行Dot-ELISA,其中有11株与其发生特异性反应.     

重组嵌合生长抑素工程菌的构建、表达与免疫

将动物生长抑素(SS)与大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(LTB)融合基因插入p ET28a系统,构建重组质粒pET28a-A4030-2-LTB并转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态中,获得了大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)p ET28a-A4030-2-LTB,然后使用SDS-PAGE检测该融合蛋白的表达并优化其发酵与包涵体洗涤条件,接着采用亲和层析法进行纯化,并用Western Blotting技术检测该融合蛋白的免疫原性.研究结果表明,在37℃,加入1 mmol/L的IPTG培养3 h后,融合蛋白的表达量最高且稳定表达;在包涵体洗涤的过程中,使用含有φ=1%的Triton X-100、2 mol/L尿素和0.5 mol/L NaCl的缓冲液洗涤包涵体沉淀,其效果最佳,用Western Blotting方法检测出该蛋白能发生抗原抗体反应,并且将重组蛋白免疫7只小鼠后,其中有6只小鼠产生了抗SS抗体,表达产物具有免疫原性.此研究为进一步开发生长抑素基因工程疫苗提供了可靠的实验依据.     

卵形鲳鲹TNFSF6的原核表达、纯化与多克隆抗体的制备

为了研究卵形鲳鲹肿瘤坏死因子配体6(TNFSF6)的功能,本研究构建了TNFSF6的原核表达载体并制备了其多克隆抗体,首先通过PCR扩增技术扩增获得了TroTNFSF6的开放阅读框序列,并构建了原核表达重组质粒pET-TroTNFSF6,随后将重组质粒转化至大肠杆菌表达菌株BL21中,进行原核表达并获得重组蛋白rTroTNFSF6.结果显示,重组蛋白rTroTNFSF6大小约46.5 kDa,其最适诱导温度为20℃,诱导时间为8 h,IPTG的最佳浓度为0.6 mmol/L.可溶性分析表明,重组蛋白rTroTNFSF6主要在沉淀中,以包涵体的形式存在.将纯化后的重组蛋白rTroTNFSF6免疫小鼠以制备多克隆抗体,ELISA检测结果表明其效价高达1∶32 000.本研究为进一步探究卵形鲳鲹TNFSF6的功能奠定了基础.     

水稻类非特异脂质转移蛋白OSDIR的表达和纯化

通过PCR方法从水稻(O ry za sa tiva)染色体基因组中扩增一个编码非特异性脂质转移蛋白(nonspec ific lip id transfer prote in,nsLTP)类似蛋白的基因(OSd ir),将该基因片段克隆到硫氧还蛋白融合表达载体pET 32a( )中后,在BL 21(DE 3)trxB-宿主菌中实现了融合蛋白的高表达,表达产物为包涵体。利用尿素溶解包涵体并复性后,再通过Sepharose N i2 -che lating fast flow柱亲和纯化融合蛋白,得到重组O SD IR蛋白。     

以Triton X-100处理重组E.coli制备重组人SOD包涵体

为替代机械破菌法破碎重组E.coli释放重组人超氧化物歧化酶rhSOD (recombinant human SOD)包涵体蛋白,采用非离子表面活性剂Triton X-100处理重组E.coli释放并提取重组人超氧化物歧化酶包涵体.以SDS-PAGE检测破菌效果,采用透析法体外复性包涵体.结果表明:经体积分数0.5％的Triton X-100处理重组E.coli制备的包涵体纯度可达65％,复性48 h,目的蛋白比活达2 801 U/mg,纯度达90％以上.与机械破菌法相比,简单实用,成本低廉,易于放大,无需特殊破菌设备,为规模化生产提供参考.     

草鱼Ⅲ型呼肠孤病毒外衣壳蛋白VP38的表达分析及多克隆抗体制备

为进一步开展草鱼Ⅲ型呼肠孤病毒外衣壳蛋白VP38的生物学功能研究准备实验材料,同时探讨并构建一种草鱼Ⅲ型呼肠孤病毒的免疫学检测方法。实验构建了VP38的原核表达质粒pET28a-VP38,转化至BL21感受态细胞后利用IPTG (Isopropylβ?D-Thiogalactoside)诱导表达,8mol/L尿素溶解重组蛋白后免疫小鼠,制备鼠抗VP38多克隆抗体;利用制备的抗体探究Grass carp reovirus-104(GCRV-104)感染后VP38在翻译水平的表达动力学;利用Western blot、间接免疫荧光分析(IFA)对抗体进行评估;构建VP38的真核表达载体pEGFP-N1-VP38,转染至草鱼性腺(Grass carp ovary,GCO)细胞内进行亚细胞定位分析。结果显示:重组VP38蛋白在原核表达系统中以包涵体形式存在;制备的鼠抗VP38多克隆抗体既能够识别重组VP38蛋白,也能够识别GCO细胞感染GCRV-104后表达的VP38蛋白;GCRV-104感染后72hVP38主要分布在细胞质中,与亚细胞定位结果一致;VP38在感染的前期微量表达,感染中后期大量表达。本研究制备的鼠抗VP38多克隆抗体具有较高的效价和较好的特异性,为构建草鱼Ⅲ型呼肠孤病毒的免疫学检测方法提供了较好的技术路线。     

食管癌相关基因2(ECRG2)包涵体的溶解与纯化

采用生物工程的手段,用插有食管癌相关基因2(ECRG2)开放阅读框(ORF)的原核表达质粒pEGX-4T-1转化大肠杆菌E.coli,诱导表达了重组的GST-ECRG2融合蛋白;收集GST-ECRG2融合蛋白包涵体,经SKL溶解后在PBS中透析复性,用GST亲和层析柱纯化,从而获得一定数量的高纯度重组ECRG2蛋白.     

细胞毒性T细胞抗原4胞外结构域的高效表达与纯化

目的:获得细胞毒性T淋巴细胞相关分子4胞外结构域(exCTLA4)在大肠杆菌中高效表达的条件,并纯化获得高纯度的重组蛋白.方法:构建原核表达质粒pET28a-exCTLA4并转入大肠杆菌Transetta(DE3)中,通过改变诱导物IPTG浓度、细菌培养温度和时间,获得了exCTLA4的最佳表达条件.收集最佳诱导条件下表达exCTLA4的菌体,将菌体超声破碎后,离心分离exCTLA4包涵体,用低浓度尿素(2mol·L~(-1))洗去大部分背景蛋白后,再用高浓度尿素(8mol·L~(-1))溶解包涵体,进一步用镍离子亲和层析方法得到高纯度exCTLA4.结果:构建了表达载体pET28a-exCTLA4,获得了exCTLA4在Transetta(DE3)中的最佳诱导条件,即在1mmol·L~(-1) IPTG、25℃下,诱导6h能得到最佳表达,但重组蛋白以包涵体形式存在.通过纯化exCTLA4包涵体及进一步的镍离子亲和层析获得了高纯度的目的蛋白,Western blot鉴定为CTLA4.结论:获得了exCTLA4重组蛋白在大肠杆菌中的最佳表达条件和纯化方法及步骤,为该蛋白的应用奠定了基础.