限制性内切核酸酶 HindⅢ及 HindⅡ的提纯及 HindⅢ某些性质的探讨

从流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)Rd 株中纯化了限制性内切核酸酶HindⅢ及部份纯化了Hind Ⅱ;探讨了纯化过程中的某些问题;检查了酶对底物双链DNA 的特异性内切作用,从琼脂糖平板凝胶电泳中观察到的经消化后产生的DNA 断片表明:酶对各种底物具有专一性作用;通过DNA 断片的重新连接证明:经Hind Ⅲ消化后生成的断片具有粘性末端,也说明纯化的Hind Ⅲ中不合明显的外切酶活力;用聚丙烯酰胺-十二烷基硫酸钠平板凝胶电泳,葡聚糖凝胶G150分子筛层析及蔗糖密度梯度离心法测定了Hind Ⅲ的分子量并对其亚单位进行了讨论.     

质粒pBR322DNA与内切酶EcoRI相互作用的研究

借助原子力显微镜(AFM)对DNA与内切酶的切割与结合作用进行研究.当缓冲液中有Mg2+存在时,内切酶EcoRI会在单一识别位点处切割pBR322DNA,如果缓冲液中的Mg2+用Ca2+代替,内切酶EcoRI则会与pBR322DNA在单一识别位点处结合,并且切割率与结合率都随着内切酶浓度的增加而增加.     

鹅源腺病毒全基因组DNA酶切片段的克隆

利用1株鹅源腺病Y81G4株,经鹅胚增殖后收获尿囊液,用差速离心法纯化病毒子并提取病毒基因组DNA,病毒DNA经Hind Ⅲ酶切后共产生10个片段,分别回收各酶切片段,与经Hind Ⅲ单酶切的pUC18连续,获得8个不同的重组质粒。对于未克隆到的两末端片段,经碱处理去除末端蛋白后,以平端和HindⅢ粘端与经SmaⅠ和 HindⅢ双酶切的pUC18连接,获得了重组质粒pGAHC和pGAHI。克隆的各酶切片段,通过酶切电泳和Southern blotting结果鉴定,证明已分别克隆到该病毒基因组DNA HindⅢ酶切片段,且各酶切片段大小之和约为32．9kb.     

硅藻DNA片段在表达质粒pMZR中再克隆的研究

用部分酶切法切开表达质粒 pMZR 中一个 HindⅢ位点后,插入了一个带 HindⅢ粘性末端的1kb 硅藻 DNA 片段重组 DNA 分子转化 E.coli LE392,对转化子中的重组 DNA 分子用酶切分析后,鉴定了1kb DNA 片段插入 pMZR 的位置。     

氧化亚铁硫杆菌启动子片段的克隆及酶切分析

本文利用DNA体外重组技术,将氧化亚铁硫杆菌染色体DNA的Hind Ⅲ酶切片段插入启动子探测质粒pSDSI(Ap~r,Tc~s,5.65kb)的Hind Ⅲ位点上,获得了一批具有启动子活性的染色体DNA片段.其中抗性最强的一株可在240μg/ml的四环素平板上生长,对此抗性最强的质粒pSDRF12进行了限制性酶切图谱分析,并利用其上的PstI和EcoRI位点分别酶切,得到了两个亚克隆pSDRF121和pSDRF122.新构建的两个亚克隆在其氧化亚铁硫杆菌启动子后只有一个Hind Ⅲ位点,可通过该位点插入外源目的基因,进一步观察其表达情况。     

限制性酶切DNA片段的计算机辅助测量

文中对几种测量限制性内切酶解DNA片段大小方法的测量精度进行了比较。在所讨论的方法中有手工半对数作图法、线性回归、组合线性回归、拉格朗日插值法、Southern法及改进的分段函数法和其计算机计算程序。用以上方法检验了λDNA/HindⅢ+EcoRⅠ酶切片段的测量精度,并测量了pSaA基因限制性内切片段大小。结果表明改进的分段函数法给出最小标准方差(Sd)及最优测量一致性。     

重要海水养殖鱼斜带髭鲷和花尾胡椒鲷16S rRNA遗传变异研究

应用PCR技术扩增了我国南方重要养殖石鲈科鱼类斜带髭鲷(Hapalogenys nitens)和花尾胡椒鲷(Plectorhinchus cinctus)线粒体DNA(mtDNA)的16S rRNA基因片段,纯化后分别进行EcoRⅠ、MseⅠ、PstⅠ、SacⅠ和HindⅢ等5种限制性内切酶酶切和测序分析.酶切结果为:斜带髭鲷16S rRNA扩增片段被MseⅠ和SacⅠ两种内切酶酶切,花尾胡椒鲷16S rRNA扩增片段只被MseⅠ酶切.两者在MseⅠ和SacⅠ酶切图谱的差异可作为区分两者的遗传标记.16S rRNA序列分析结果表明,斜带髭鲷和花尾胡椒鲷的遗传相似度为86.94 %,遗传差异为13.06 %.进化上,两者分化年代大约为1.98×106年前.     

常现青霉(Penicillium frequentans)β-半乳糖苷酶的纯化及其性质

从常现青霉麸曲中抽提的β-半乳糖苷酶(E.C.32。1.23,亦称乳糖酶)粗制品,经两次硫酸铵盐析沉淀和DEAE纤维素柱层析,纯度提高了近55倍,纯化酶的最适反应温度为62～65℃,最适反应pH为4.0。于pH2.2～8.0放置过夜,酶活性基本稳定。以邻硝基苯酚β-半乳糖苷(ONPG)为底物时该酶的K_m为2.06 mmol/L。Cu~(++),Fe~(++)和N-溴代琥珀酰亚胺(NBS)对酶活性有明显的抑制作用,Mn~(++)为该酶的激活剂。     

坛紫菜(Porphyra haitanensis)叶绿体DNA 的快速提取

以阴干的坛紫菜叶状体为材料，通过酶解等方法获取完整的叶绿体．再裂解叶绿体并酚仿抽提获得叶绿体DNA．限制性内切酶Hind Ⅲ和EcoR Ⅰ双酶切及RAPD检测结果显示：叶绿体DNA与基因组DNA的酶切图谱及RAPD图谱均有比较明显的差异．多次重复实验证明，按此法提取的叶绿体DNA．其得率稳定，并可用作PCR扩增的模板及酶切图谱的构建等．该方法操作简便．过程快捷．可作为大型海藻叶绿体DNA提取的参考方法．     

正常和细胞质雄性不育水稻线粒体DNA限制性内切酶的酶切图谱分析

从N,cms-WA,cms-BT和cms-RL四种不同细胞质源的水稻中制备线粒体DNA。用限制性内切酶Pst Ⅰ,Hind Ⅲ和Xho Ⅰ等酶切线粒体DNA经琼脂糖凝胶电泳,发现水稻N,cms-WA,cms-BT和cms-RL细胞质确有不同的线粒体DNA,不同的保持系之间也存着一定的差异。水稻线粒体DNA最小分子的大小在195～245kb之间。     

中国棉铃虫核多角体病毒(Heliothis armigera NPV)VHA273毒株DNA的酶切分析与比较研究

VHA273毒株原为MNPV型,经纯系中国棉铃虫扩增而得出约10％的SNPV.高度纯化两型多用体,温和碱解后,酚法抽提SNPVDNA和MNPVDNA.限制性内切酶BglⅡ,BamHI,EcoRI和HindⅢ分别平行酶切两种DNA,依次均得出11,8,14和13条电泳带．比较分析DNA的酶切电泳图谱发现,经同一种限制性内切酶酶切,SNPVDNA与MNPVDNA不仅电泳片段数相同,电泳带位也-一对应．讨论提出：该SNPVDNA与MNPVDNA在分子、亚分子水平上是一致的．     

聚乙烯基吡咯烷酮对质粒DNA降解效应的研究

为评估聚乙烯基吡咯烷酮（Polyvinylpyrrolidone,PVP）的生物可利用性,研究了不同相对分子质量PVP对闭合环状双链质粒DNA pBR322的降解效应.实验结果表明：在常温、非光催化条件下,相对分子质量小的PVP（PVP8000）可引起质粒DNA构象的改变,并且这种效应与反应温度、反应时间及PVP的相对...     

牛蛙mtDNA的一种提取方法及初步酶切分析

本文中使用牛蛙作为材料提取mtDNA进行RFLP分析.探讨提取牛蛙mtDNA的方法及酶切图谱.结果表明,按本实验操作方法能够提取足量牛蛙的mtDNA,用以酶切分析.采取KpnI.Xho.SacI.PstI.HindⅢ等五种限制性内切酶酶切牛蛙mtDNA,能够粗略求出它的分子量大约在20kb左右.     

脂肪嗜热芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)产生的限制性内切酶BstFI、BstSI的分离鉴定

从脂肪嗜热芽孢杆菌FH58和S183中分别分离到Ⅱ型的限制性内切酶BstFⅠ和BstSⅠ。经鉴定,BstFⅠ的识别顺序和酶切位点为A/AGCTT,与Hind Ⅲ一致;BstSⅠ的识别顺序和酶切位点为C/PyCGPuG,与AvaⅠ一致。经肝素琼脂糖凝胶提纯,每克湿菌体可分离到10000单位的BstFⅠ或24000单位的BstSⅠ。BstFⅠ在45℃中保温6h,比活力不变,在50℃中保温1h比活力下降50%;而BstSⅠ在55℃中保温6h,比活力不变,在70℃中保温1h,比活力仅下降10%。     

Klenow大片段聚合酶及T4DNA聚合酶在构建重组质粒中的应用

利用大肠杆菌Klenow大片段聚合酶5＇→3＇聚合酶活性和T4DNA聚合酶3＇→5＇外切酶特性构建植物高效表达载体pBLT35Svp4-ST.用pUC18-435S中的T35S启动子取代植物表达载体pBLG-VP4-ST中的双35S启动子,通过Klenow大片段的聚合酶活性对植物表达载体pBLG-VP4-ST中的HindⅢ3＇凹端补平,再利用T4DNA聚合酶外切酶活性将质粒pUC18-435S的四倍35S启动子即T35S中的SacⅠ3＇凸端削平.在T4DNA连接酶作用下将一端为平端,另一端为BamHⅠ的粘性末端的四倍35S启动子定向连接到植物表达载体PBLG-VP4-ST中取代原有的双35S启动子,转化并筛选阳性克隆.结果经PCR和酶切鉴定证实,四倍35S启动子成功连接到植物表达载体PBLG-VP4-ST中.     

黑色葡萄状穗霉纤维素酶的纯化和性质

将筛选所得的黑色葡萄状穗霉（Stachybotrys atra)S607发酵培养96h，发酵液离心去除菌体，上清液经超滤、Sephadex-G100柱层析、DEAE－Sepharose fast flow弱阴离子交换层析、CM－Sepharose fast flow阳离子交换层析、Q－Sepharose fast flow强阴离子交换层析及置换层析等步骤，得到了4种电脉纯的酶组分，即内切纤维素酶EGⅠ、EGⅡ、EGⅢ和β葡萄糖苷酶（βGase）。利用SDS－PAGE测得4种酶组分的分子量分别是78.3、58.1、72.4和55.6kDa。3种内切酶组分的最适温度都是50℃，β葡萄糖苷酶为55℃，它们的最适pH值分别是6.0、7.0、6.5和6.0。底物专一性的实验表明，内切酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ都可作用于木聚糖。     

B7-1和新型隐球菌DHA1基因嵌合重组质粒的构建

目的构建包含新型隐球菌细胞免疫主要相关基因-迟发超敏反应抗原基因(delayed-type hypersentivity antigen 1，DHA1)与小鼠共刺激分子B7-1的嵌合重组质粒。方法设计合成两对寡核苷酸引物。用PCR法分别从pUCmB7-1TM和新型隐球菌重组质粒pcDNA3-DHA1中特异扩增出编码B7-1和DHA1的基因片段(921和984bp)。分别用HindⅢ、EeoRⅠ、XbaⅠ酶切后。逐个定向连接到质粒pcDNA3中，转化宿主菌DH-5α．分别用上述内切酶酶切及DNA测序鉴定重组质粒。结果酶切鉴定示所切下的片段大小均与预计相符，测序结果与献报道序列及预计结果一致。证实符合表达框架。结论本实验成功构建了新型隐球菌嵌合重组质粒pcDNA3-B7-1-DHA1。为进一步研究新型隐球菌DNA免疫奠定了基础。     

通过酶促拆分制备S(+)3-甲基-1-(2-(1-哌啶基)苯基)丁胺

以脂肪酶Novozym435为催化剂,乙酸乙酯作溶剂和酰基供体,酶促合成瑞格列奈关键中间体S(+)3-甲基-1-(2-(1-哌啶基)苯基)丁胺,总收率为17%.该酶促拆分方法较化学拆分法具有高度的对映选择性及底物的专一性,副反应少,反应条件温和,合成路线易于操作,酶经活化后可重复利用.     

DNA序列分析中克隆片段在M13的缺失及质粒载体的应用

应用新的亚克隆载体BLUESCRIPT M13克服了外源DNA缺失问题.采用外切核酸酶Ⅲ快速亚克隆法,在不知道任何内切酶位点的情况下,也能获得一系列适应于DNA顺序分析的重叠衔接克隆.用超螺旋双股DNA直接序列分析程序,简化了DNA序列分析工作.