乳酸乳球菌电转化条件的研究

以质粒pTRKH2为材料,对乳酸乳球菌MG1614进行电转化条件的研究.实验结果表明,在电转化过程中,电场强度、电阻大小、细胞生长状态和电击后菌株复苏时间均对转化效率有明显影响,得到了乳酸乳球菌的最适电转化条件为:对数生长中期的细胞,经1%甘氨酸处理,在10kVcm电场强度、400Ω电阻下电转化,转化后细胞在SGM17培养液中培养2h后涂布选择性培养基,转化率(转化子个数与DNA质量之比)可达1.2×103个μg,比优化前的转化效率提高近100倍.     

大肠杆菌JM109菌株高效电转化条件的研究

通过感受态细胞的生长状态、转化温度及不同的电击杯内径、电压等影响电转化的重要条件,探讨索了大肠杆菌JM109菌株电转化的最优条件.在感受态细胞OD600值为0.5-0.7,转化环境温度为4℃,电容25 μF、并联电阻200 Ω、电压2.5 kV和0.2 cm电击杯电转化效率最高,可达到9.12×108.     

响应面法优化乳酸乳球菌电转化效率研究

乳酸乳球菌NZ9000是乳酸菌食品级高效蛋白表达系统中使用最广泛的宿主菌株。为获得高效的电转化效率,首先采用单因素试验,对影响NZ9000电转化效率的各因素:生长阶段、甘氨酸浓度、质粒浓度、电场强度、复苏培养和复苏时间进行优化;然后利用响应面法对其中的关键因素进一步优化,确定最佳电转化条件为吸光值OD600 0.2,甘氨酸浓度8 g/L和电场强度12.5 kV/cm,电转化效率达到3.76×10~7 CFU/μg DNA,比优化前提高了250%。本研究通过优化乳酸乳球菌NZ9000感受态的制备方法,提高了电转化效率,为深入挖掘乳酸乳球菌感受态潜力奠定了基础。     

生物表面活性剂生产菌株培养条件优化的研究

对生物表面活性剂生产菌W2的培养条件进行研究,以获得最佳的菌株生长条件和最佳的产生物表面活性剂条件.结果表明:W2产生物表面活性剂的最佳培养基成分(g/L)为葡萄糖40.0,NaNO32.67,K2HPO41.0,KH2PO40.5,KCl 0.1,MgSO40.5,CaCl20.01,FeSO4.7H2O0.01,酵母提取物0.1.W2产生物表面活性剂的培养基最适宜pH=6.5,接种量为1%,最适温度为30℃.针对其产生物表面活性剂和菌体生长的关系,将分段培养工艺应用于W2产生物表面活性剂中,即在培养的初期24h内采用菌体生长最佳培养条件,在培养后期采用菌体产生物表面活性剂的最佳培养条件.     

钼酸盐-柠檬酸盐络合物及有机酸对棕色固氮菌生长的影响

将经过0.9%NaCl溶液处理8h的棕色固氮菌(AzotobactervinelandiiOP)作为菌种分别接入Burk′s培养基和用不同有机酸替代柠檬酸三钠或用不同等摩尔的钼络合物替代钼酸钠的各种改良的Burk′s培养基中,分别测定菌体生长曲线和固氮活性.结果发现,与Burk′s培养基相比,以高柠檬酸、苹果酸、马来酸替代柠檬酸三钠或以K6[Mo2O5(cit)2]·5H2O、K4[Mo2O5(Hcit)2]·4H2O和Na2[MoO2(Hcit)]·3H2O替代柠檬酸三钠和钼酸钠的培养基能促进菌体的生长;以乙醇酸替代柠檬酸三钠的培养基则会抑制固氮菌的生长;各种培养条件下菌体细胞的C2H2还原活性表现了类似的规律.讨论了固氮酶活性中心FeMoco在装配过程中钼的可能运输方式和装配机理.     

Red重组系统介导下大肠杆菌改造体系的优化

对Red重组系统介导下大肠杆菌进行遗传改造的转化条件、诱导条件、复苏条件三方面实验参数进行优化研究。结果表明:电转化加入的DNA为20ng,Red重组系统感受态细胞培养浓度为OD600=0.60,所需的电击感受态细胞数为3×108;对大肠杆菌基因做双敲除时,突变第2个基因的阿拉伯糖诱导最适时间比突变首个基因延长,诱导浓度为40μm,复苏时间变化对体系影响不显著。     

酵母细胞膜透性变化对发酵油莎豆粕制乙醇的影响

研究发现,通过在发酵培养基中添加0.8mmol/L棕榈酸可将燃料乙醇产量提高12.7%.生长在培养基中分别添加棕榈酸、亚油酸和不添加任何脂肪酸的菌体经过18%(v/v)乙醇冲击7h,酵母存活率分别为39%、5%和0%.生长于不同脂肪酸条件下酵母的细胞膜富含各自所添加的脂肪酸.菌体生长曲线表明在稳定期,生长于添加棕榈酸条件下的菌体的细胞浓度最大.菌体膜透性由大到小排列顺序为:不添加脂肪酸、添加亚油酸、添加棕榈酸;这与菌体乙醇耐性由弱到强的顺序完全一致,这说明菌体乙醇耐性的提高与细胞膜透性维持较低水平存在密切联系.从乙醇生成动力学模型参数分析可知:随着菌体乙醇耐性的增强,细胞的生长速率和细胞浓度对产物生成速率的贡献也在逐渐加强,这说明在发酵培养基中添加棕榈酸对于缩短发酵周期是有可能的.     

运用绿色荧光蛋白探讨肉葡萄球菌双精氨酸分泌途径

根据肉葡萄球菌(Staphylococcus carnosus)TM300的基因组序列设计引物,经PCR扩增得到其tufA基因的启动子Peftu片段与大肠杆菌–葡萄球菌穿梭载体pBT2-Tat-GFP连接,构建了穿梭质粒pBT2-ETG.结果表明,穿梭质粒pBT2-ETG成功地转入大肠杆菌与肉葡萄球菌宿主中稳定表达具有活性的绿色荧光蛋白GFP,并被转运到肉葡萄球菌宿主的细胞壁,为进一步研究肉葡萄球菌双精氨酸(Tat)转运系统正确分泌其他外源蛋白奠定了实验基础.     

高效电转化率条件的探索

对影响ＤＮＡ电转化效率的主要因素进行探索,结果表明：在相同的电场强度、电阻入电容条件下,电中时间的长短对电转化交谊级较大影响,电脉冲时间太长或太短均使转化效率降低;用对数生长早中期的细菌制备感受态细胞,经液氮速冻后储存于－７０℃,能获得高转化效率。     

乳酸菌电转化条件研究

乳酸菌是一类重要的革兰氏阳性菌,已广泛应用于食品、轻工业、医药、饲料等多个领域,是公认的具有较高经济价值的微生物.乳酸菌的遗传转化是限制其遗传操作的关键因素,制约着乳酸菌表达外源基因、基因功能鉴定和代谢机制的研究.本文综述了细胞收获时期、细胞壁削弱剂、质粒、电击参数等因素对乳酸菌电转化效率的影响,并对其中部分影响因素的作用机制进行了初步的探讨,旨在为乳酸菌电转化研究提供借鉴和参考.     

丁酸梭菌培养条件的研究

采用多种培养基及培养技术 ,研究丁酸梭菌的生长情况 ,寻找最适培养基和培养方法 .实验结果表明 :丁酸梭菌为厌氧菌 ,在较低的氧化还原电位下生长良好 ,运用封石蜡凡士林法和焦性没食子酸法厌氧培养长势都很好 .在牛肉膏蛋白胨培养基和基本培养基上不生长 ,在疱肉培养基、改良疱肉培养基、改良牛肉膏蛋白胨培养基、完全培养基和磷酸缓冲液培养基上均能生长 ,其中磷酸缓冲液培养基为最佳培养基     

美国Diamond V Mills公司饲料添加剂菌体生长动力学

在不同温度、不同pH值,不同培养基组成以及通风的条件下,研究了美国DiamondV Mills公司饲料添加剂菌体生长动力学,求出了各种条件下的动力学参数,找出了菌体生长的最适温度(29℃)和最适pH值(pH5.3),为实现最优控制奠定了基础。     

Rhodobacter Sphaeroides的番茄茄红素含量研究

旨在研究RhodobacterSphaeroides适宜培养条件下番茄红素的含量.通过试验发现,在厌氧、30℃条件下,培养基中加入0.01g·L-1Fe3+,有利于提高番茄红素的含量(P<0.05),培养基中Mg2+浓度对其产量影响不显著(P>0.05).而且当光照强度为3000Lux时培养的菌体中番茄红素的含量最高.处于生长稳定初期(6d)RhodobacterSphaeroides中番茄红素的积累量可达57.3μg·mg-1.     

絮凝剂产生菌克雷伯氏杆菌的筛选、鉴定及培养条件优化

采用常规细菌分离方法从木薯淀粉黄浆废水中筛选得到一株微生物絮凝剂产生菌,编号为M2。经过形态学特征、生理生化反应试验和16S rDNA基因序列分析鉴定该菌株为克雷伯氏杆菌,命名为Klebsiella sp.M2。通过单因素实验对菌株M2培养条件进行优化,结果表明最佳培养基种类、培养基初始pH值、培养温度及摇床转速分别为查氏培养基、5、30℃及150r/min。与大部分微生物絮凝剂产生菌上清液表现出絮凝性不同,菌株M2的菌体本身表现出絮凝活性;经过使用超声波破碎仪证明菌体本身具有絮凝活性,最佳絮凝率达到93.20%,具有易于运输、便于使用的优点。菌株M2在以蔗糖作为碳源、KNO3作为氮源的情况下絮凝活性最好。     

2-酮基-D-葡萄糖酸产生菌Ac9抗噬菌体菌株的选育

以2-酮基-D-葡萄糖酸产生菌Ac9为出发菌株,采用紫外线诱变与添加噬菌体进行筛选相结合的方法,获得了两株抗性菌株Au4-2和Af3.在种子培养基中含有噬菌体的条件下,31℃,摇瓶培养24 h,抗性菌株Au4-2与Af3的菌体生长光密度值OD650×20分别为0.74,0.55.镜检显示菌体量多,呈短杆状;而对照菌株Ac9的菌体光密度值则为0.14,镜检显示菌体量少,呈球状.在发酵培养基中添加噬菌体的条件下,31℃,摇瓶培养72 h,抗性菌株Au4-2与Af3 产酸分别可达15.45 g/100 mL,14.55 g/100 mL;而对照菌株则几乎没有产酸.     

好氧反硝化细菌的筛选及培养条件的初步研究

通过涂布平板分离法从养殖水体污泥中共分离到12株好氧反硝化细菌,通过反硝化能力的测定,从中筛选出1株具有较强反硝化作用能力的菌株(D2),并以此为研究对象,进行最适培养基、生长温度及菌体浓度的测定。结果表明菌株D2的最适培养基为硝酸盐培养基,最适生长温度为37℃左右,在最适培养条件下最高生长浓度为4.2×105/mL。     

产碱杆菌DN25降氰酶产酶条件初步优化

以实验室保藏的一株具有高效降氰活性的菌株Alcaligenes sp. DN25为研究对象,通过分析其降解产物,发现终产物中存在甲酸,初步判断此菌株降氰反应为氰水解途径。在培养基中添加KCN来考察底物对菌体产酶的诱导作用,结果发现菌体的活力没有提高,表明菌株DN25所产降氰酶应为组成型酶。在培养基中添加4种金属离子和4种含硫物质,其中微量金属离子对菌体的生长和活性均有抑制;Na2SO4和Na2S2O3对菌体生长和产酶均无明显影响;DL-半胱氨酸对菌体产酶有明显促进作用,DL-甲硫氨酸可同时提高菌体的生长量和产酶水平,从而提高发酵液比活力。研究结果为降氰酶的大量获得以及酶制剂在氰污染治理方面的应用研究奠定了基础。     

用于电转染NIH3T3细胞的两种电击介质的比较

分别采用不含钙镁离子的PBS与电转缓冲液,利用电穿孔转染法将带有增强型绿色荧光蛋白(e GFP)的pe GFP-N1质粒转染到NIH3T3细胞中.所用的电转参数为:电压6 V,脉冲数2,脉冲时间1ms.结果表明,无钙镁的PBS的电转效率高达(21.2±2.1)%,而电转缓冲液的电转效率只有(3.8±1.4)%.在电转后加入G418筛选,用不含钙镁离子的PBS为电击介质的细胞状态正常且大量增殖.因此,通过对转染效率以及对细胞损伤的对比,无钙镁的PBS更适合作为NIH3T3细胞的电击介质.     

碳和氮源以及pH对耐有机溶剂葛根素糖基化菌株Lysinibacillus fusiformis CGMCC 4913生长及转化活性的影响

本实验从当地土壤样品中分离纯化得到一株耐有机溶剂菌株Lysinibacillus fusiformis CGMCC 4913,具有通过菌体细胞生物转化反应将葛根素转化得到葛根素-7-O-果糖苷的能力.本研究探讨碳源、氮源以及p H等培养条件对L.fusiformis CGMCC 4913菌体生长及其转化活性的影响.研究表明,LB培养基完全可以为L.fusiformis CGMCC 4913菌株生长提供碳源,蛋白胨和胰蛋白胨为氮源培养得到的菌株转化活性良好,在p H 7.0条件下LB培养基培养L.fusiformis CGMCC 4913菌株,菌株生长较好,有较高的转化活性且活性相对稳定.     

巴斯德毕赤酵母高密度发酵表达rHCMVp的研究

目的：提高人巨细胞病毒嵌合肽(rHCMVp)在巴斯德毕赤酵母中的表达量,并进行发酵罐高密度发酵。方法：将生长培养基的菌体离心后等量接入诱导培养基中(包括不同体积分数的甲醇、pH值)培养,通过菌体密度检测和发酵液上清的SDS—PAGE结果分析不同条件、不同诱导时间对人巨细胞病毒嵌合肽表达的影响,并依据优化条件进行高密度发酵。结果：摇瓶培养时,转化子在体积分数1％的甲醇pH6．0的条件下诱导72h,A600(菌体密度)为45．2,目的蛋白表达量达到10．2mg／L。2L发酵罐进行了高密度发酵,经体积分数1％甲醇诱导48h,最终A600(菌体密度)达到124,每升发酵液中含目的蛋白57．21mg。结论：通过条件优化,进行高密度发酵,获得大量的rHCMVp。