过表达甘油激酶三角褐指藻藻株富集油脂的研究

为了得到高产并符合生物柴油标准的微藻油脂的藻株,本文研究了在外源甘油存在的情况下野生型（WT）三角褐指藻（Phaeodactylum tricornutum）,甘油激酶过表达藻株（GKOE）以及甘油激酶RNA干扰藻株（GKRNi）在添加浓度为20 mmol/L外源甘油的培养基中的生长情况、油脂产量以及脂肪酸组成.结果显示：（1）甘油兼养的GKOE藻细胞浓度可达到2.23×107个/mL,明显高于甘油兼养的WT的1.79×107个/mL和GKRNi的1.78×107 个/mL;（2）甘油兼养的GKOE油脂含量可达到31.73%,比甘油兼养的WT和GKRNi分别高了27.20%和26.63%;（3）尼罗红染色显示甘油兼养的GKOE荧光强度比甘油兼养的WT和GKRNi分别高16.26%和17.83%;（4）甘油兼养的GKOE总脂肪酸产量可达到0.052 mg/mL,比甘油兼养的WT和GKRNi高了36.84%和10.64%,说明其油脂适合于生物柴油开发.     

二酰基甘油转移酶对三角褐指藻油脂积累及相关环境因子响应的研究

本文应用RT-PCR和RACE方法扩增出三角褐指藻二酰基甘油转移酶(Ptdgat)全长cDNA,其完整编码框(ORF)为1587 bp,编码528个氨基酸.基于克隆所得Ptdgat的ORF构建了反向互补RNA干扰载体,并用基因枪PDS-1000/He转化野生型三角褐指藻,筛选到了所需的阳性转基因藻.实时荧光定量PCR(qPCR)结果揭示:含Ptdgat RNA干扰结构的转基因藻的二酰基甘油转移酶的表达水平比野生型三角褐指藻该酶的表达水平有显著降低;野生型藻和转基因藻的油脂含量定量分析结果揭示:含RNAi干扰结构的转基因三角褐指藻油脂含量也明显低于野生型三角褐指藻.另外本文也揭示了适当浓度的外源培养因子铁、硅和脱落酸(ABA)提高了三角褐指藻Ptdgat基因的表达水平及其油脂含量.     

同源重组敲除三角褐指藻基因的研究

为探索应用基因敲除技术研究三角褐指藻基因功能的研究体系,本文以三角褐指藻甘油激酶基因作为靶基因,构建了同源重组基因敲除载体,利用微弹轰击法将该载体成功转化至三角褐指藻中,经100μg/mL Zeocin筛选和PCR验证获得了34个阳性转基因藻株;并进一步对三角褐指藻甘油激酶基因敲除转基因藻株的甘油激酶表达量和生长两方面进行分析,结果显示胞外甘油兼养不影响转基因藻细胞生长,甘油激酶不表达或表达量降低.本文通过构建敲除载体,完成了遗传转化,筛选获得阳性转基因藻,并进一步研究了转基因藻的性状,最终建立了应用同源重组基因敲除技术靶向研究三角褐指藻基因功能的研究体系.     

三角褐指藻甘油兼养条件下甘油激酶的功能研究

本研究利用RT-PCR结合 RACE 方法扩增出了三角褐指藻甘油激酶(PtrGK)基因全长 cDNA序列,其完整 ORF为2079 bp,编码692个氨基酸。基于上述序列构建了甘油激酶原核表达载体。构建反向互补RNA干扰载体并转化野生型三角褐指藻,得到含有甘油激酶反向互补干扰结构的转基因藻。研究表明：其甘油激酶表达水平、利用某油速率和细胞分裂速度都较野生型藻有了较大程度的下降。说明甘油激酶对三角褐指藻甘油兼养生长的重要作用。     

RNA干扰PEPC对三角褐指藻油脂含量的影响

本文应用生物信息学和RT-PCR方法分别获得了三角褐指藻两个PEPC全长cDNA,分别称为:PtPEPC1和PtPEPC2,前者完整开放阅读框3030bp,编码1009个氨基酸,后者完整开放阅读框2634bp,编码877个氨基酸;基于克隆所得PtPEPC的ORF构建了反向互补RNA干扰载体pPha-PtPEPC1RNAi和pPha-PtPEPC2RNAi,并用轰击法(PDS-1000/He)转化野生型三角褐指藻,筛选鉴定到了所需的阳性转基因藻;实时定量RT-PCR结果揭示:含PtPEPC RNA干扰结构的转基因藻的PEPCase基因的表达水平比野生型三角褐指藻该酶的表达水平有显著降低;野生型藻和转基因藻的油脂含量定量分析结果揭示:含RNAi干扰结构的转基因三角褐指藻油脂含量也明显高于野生型三角褐指藻,油脂增幅达2%~12%.     

三角褐指藻PPDK基因RNAi载体的构建和基因枪转化

三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum)的全基因组序列已经公布,为了把RNAi的技术应用于三角褐指藻的相关研究中,以C4途径关键酶丙酮酸磷酸二激酶基因(PPDK)为试验对象,构建了用于表达与PPDK部分序列同源的发夹RNA(hpRNA)的载体pPPDKi,并用基因枪方法成功将PPDKi和Zeocin抗性基因sh ble共转化到三角褐指藻细胞中.摸索出的较优基因枪转化的条件为:使用50%海水f/2培养基预培养的藻进行微粒轰击,轰击压力10.5 MPa,钨粉直径1.0 μm,轰击距离6.5 cm.PCR 检测结果表明,在Zeocin筛选的阳性藻株中约有60%同时整合了PPDKi序列.将其中6株共转化的转基因藻与野生型藻的生长速率进行比较,发现它们的生长受到4.6%～10.7%的抑制.这可能是PPDKi的表达影响了丙酮酸磷酸二激酶(PPDK)的活性,从而进一步影响了三角褐指藻的生长,但也有可能是外源片段的插入影响了其他基因的正常表达,导致细胞活动异常.     

外源一氧化氮调控三角褐指藻响应氮胁迫的作用研究

为探究外源一氧化氮(Nitric Oxide, NO)对三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum)响应氮胁迫的作用,本研究通过添加外源NO供体硝普钠(Sodium Nitroprusside, SNP)及NO清除剂[2-(4-carboxyphenyl)-4,4,5,5-teramethylimidazoline-1-oxyl-3-oxide, cPTIO],探讨外源NO对氮胁迫条件下的三角褐指藻细胞密度、叶绿素含量、叶绿素荧光参数、岩藻黄素含量、油脂相对含量等的影响。结果表明,缺氮会抑制三角褐指藻细胞的生长,显著降低叶绿素a (chla)含量与光合效率,降低岩藻黄素含量,增加脂质合成。与氮正常情况下相比,在缺氮条件下添加200μmol/L SNP可在一定程度上缓解缺氮对三角褐指藻生长、叶绿素含量、光合效率与岩藻黄素积累的抑制,并能显著促进油脂的积累。在缺氮条件下添加50μmol/L cPTIO对三角褐指藻的生长、叶绿素含量、光合效率及物质积累影响不大。本研究可为探明外源NO调控三角褐指藻响应氮胁迫的作用机制提供基础数据,也为进一步提高逆境条件下三角褐指藻的生物量...     

转基因小球藻生长动力学、藻粉和油脂产量的研究

对3株导入外源基因的转基因小球藻(Chlorella ellipsoidea SD-0702,C.ellipsoidea SD-0705,C.ellipsoidea SD-0706)进行生长动力学、藻粉产量和产油脂能力的研究,并且与野生型小球藻(C.ellipsoidea SD-0701)进行比较.结果表明:(1)SD-0705的比生长速率最大,代时最短,与SD-0706的比生长速率均高于SD-0701,SD-0702则低于SD-0701;(2)SD-0705和SD-0706的藻粉得率均高于SD-0701,SD-0702则较野生型小球藻低;(3)SD-0705的油脂产量最高,为0.470 g/L,高于SD-0701,其他2株转基因小球藻的油脂产量均低于野生型小球藻.由此筛选出SD-0705作为藻粉和油脂的高产藻株.     

gpd1基因莱茵衣藻表达载体构建及农杆菌介导转化莱茵衣藻

甘油3-磷酸酰基转移酶基因(gpd1)可以调控植物脂质代谢中关键酶甘油-3-磷酸脱氢酶(GPDH)的活性,能促进植物脂质合成。本研究以莱茵衣藻FACHB-479为受体,通过克隆酵母gpd1基因,构建莱茵衣藻的农杆菌双元表达载体pRI-Ble-GPD1,首次以农杆菌介导法将携带在农杆菌LBA4404的gpd1基因转移到FACHB-479基因组。在含有10μg/m L博莱霉素的TAP平板筛选得到抗性藻体细胞。经过分子生物学PCR及RTPCR鉴定,获得转基因藻FACHB-GPD。尼罗红染色法鉴定分析FACHB-GPD细胞中油脂含量增高1.3~1.52倍。该研究表明农杆菌介导外源gpd1基因在莱茵衣藻FACHB-479基因组的过表达能增加脂肪酸含量,从而提高其产油能力。     

不同氮源对骨条藻光合活性、生长和中性脂积累的影响

研究了硝酸钠、氯化铵和尿素作为单一氮源对骨条藻的光合活性、生长及中性脂积累的影响.结果表明:最适合骨条藻生长的氮源是氯化铵,其次是尿素,最后是硝酸钠,3种氮源的最适浓度均为4.4×10-4mol/L,光合活性的结果与藻的生长基本一致.3种氮源各浓度梯度的中性脂积累量最大值基本都出现在第7天(培养时间为8d),与藻的生长不是同步关系.最适合骨条藻中性脂积累的氮源是氯化铵,最适浓度为8.8×10-6mol/L,其最高油脂含量为31.07%.硝酸钠组的最高油脂含量为28.46%,略高于尿素组的最高油脂含量27.99%,但尿素组最适合中性脂积累的氮源浓度为1.8×10-5mol/L,低于硝酸钠组的最适氮源浓度1.8×10-4mol/L.在高接种量的条件下,骨条藻油脂总量的高低与百分含量的高低是基本一致的.     

博来霉素对转基因椭圆球藻(Chloroidium ellipsoideum)生长及油脂积累的影响

为了探究博来霉素对野生型椭圆球藻(Chloroidium ellipsoideum,SD-0701)和导入外源基因Gus的转基因椭圆球藻(SD-0702)生长以及油脂积累的影响,在Knap培养基中添加不同质量的博来霉素,测量2个藻株在不同处理下的细胞密度、藻粉产量以及油脂产量.结果发现,培养基中不添加博来霉素时,SD-0701的生长速率、藻粉和油脂产量均高于SD-0702.培养基中添加博来霉素能够抑制SD-0701和SD-0702的生长,对SD-0701的抑制作用更明显.培养基中博来霉素的质量浓度为4μg/mL时,2个藻株的生长就开始受到抑制,博来霉素对SD-0701的抑制率达到87.31%,对SD-0702的抑制效果不明显,抑制率仅有12.23%. SD-0701对博来霉素更敏感,添加了博来霉素的处理组中,SD-0701的藻粉产量微小无法制备;SD-0702在不同质量浓度的博来霉素培养基中均能够生长,且可获得藻粉和油脂,但产量随着博来霉素质量浓度的增加而降低.博来霉素质量浓度为4μg/mL时,SD-0702的藻粉产量和油脂产量抑制率分别为12.44%和8.49%,博来霉素质量浓度高达16μg/mL时,藻粉产量和油脂产量的抑制率分别为66.31%和75.46%.低质量浓度博来霉素(≤8μg/mL)对SD-0702的含油率有提升作用,高浓度则会降低SD-0702的含油率.以上结果表明,野生型椭圆球藻中导入外源基因Gus会轻微抑制细胞生长,但增强了椭圆球藻对抗生素的抗性,使其能够在低抗生素污染水体中生长并生成代谢物.     

强光下一氧化氮对三角褐指藻EPA产量的影响

二十碳五烯酸(EPA)是一种长链多不饱和脂肪酸,具有重要的医药价值.本文研究了光照强度和亚硝基铁氰化钠(SNP)分解产生的NO对三角褐指藻EPA产量的影响及机理.采用氧电极法探究光照强度与三角褐指藻光合速率的关系,结果显示三角褐指藻的光饱和点为126.3μmol/(m2·s).采用气相色谱法检测EPA的含量,结果显示外源NO可通过促进强光下三角褐指藻的快速生长来提高强光下三角褐指藻EPA的产量,而对单位生物量中EPA含量并没有影响;用血球计数板法检测三角褐指藻的生长速率,结果显示在光强200μmol/(m2·s)时三角褐指藻出现了光抑制,而SNP能解除这种抑制.探究NO促进三角褐指藻快速生长的机理,结果显示NO提高了乙醇酸氧化酶(GO)的活性.用实时荧光定量PCR(Real-time PCR)检测外源NO对GO基因表达量的影响,结果显示GO的两个同工酶"GOX和GLY"的基因表达量均增强了.采用AMCA开关法对纯化的GO进行S–亚硝基化鉴定,结果显示GOX和GLY均发生了S–亚硝基化修饰.分别采用ISNO-AAPair、GPS-SNO和ISNO-Pse AAC方法预测S–亚硝基化位点,结果显示GLY的238位、GOX的237位和332位很可能是NO的修饰位点.因此,NO提高GO活性的途径有两条:提高GO基因的表达量;对GO酶蛋白进行S–亚硝基化修饰.综上所述,NO通过提高GO活性促进强光下三角褐指藻的快速生长从而提高三角褐指藻EPA的产量.     

猪粪废水用于三角褐指藻培养的研究

研究了以猪粪废水培养一株三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum)的可行性.结果表明:猪粪废水经30g/L盐水适当稀释后可直接用于三角褐指藻的培养,无需添加其他营养物质.在污水稀释率为25倍时,藻细胞可良好地生长,最高密度为合成培养基的1.52倍.同时三角褐指藻有效去除了污水中的氮磷,总氮、氨氮和总磷的去除率分别为23%,93%和93%.与合成培养基养殖的藻相比,猪粪废水养殖的三角褐指藻的二十碳五烯酸和多不饱和脂肪酸的含量略有上升,实现了培养三角褐指藻转化废水为生物量并积累多不饱和脂肪酸的资源化.     

三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutm) 油脂富集培养的研究

探讨了营养盐铁、硅及植物激素脱落酸(ABA)单因子对三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum)的生长、油脂含量(%干重)及油脂产量的影响.采用光密度值OD450评价微藻的生长状况,以溶剂浸提法提取油脂.结果表明:(1)铁处理组中,铁浓度在0～46.57 μmol/L范围内时,藻的生长速率随铁浓度提高而增大;铁浓度为11.64 μmol/L时,油脂含量达30%,高于其它铁浓度培养;当铁浓度为11.64 μmol/L时,油脂产量最高--是无铁培养的2.8倍;(2)硅处理组中,低含量硅盐(4.6 μmol/L)不仅促进了藻的生长而且提高了油脂含量,油脂产量比高含量硅盐(42.6 μmol/L)培养提高了40%;(3)ABA处理组中,1 mg/L ABA不仅促进了藻的生长而且提高了油脂含量,油脂产量比对照提高了50%;5 mg/L ABA虽提高了油脂含量但却抑制了藻的生长,油脂产量和对照相当;15 mg/L ABA抑制了藻的生长、降低了油脂含量.用气相色谱分析微藻的脂肪酸组成,结果显示:1 mg/L ABA明显影响了三角褐指藻的脂肪酸组成,以高产量油脂(4.6 μmol/L硅盐、1 mg/L ABA培养)为原料制备出的生物柴油的质量将会提高.     

马铃薯乙醇酸氧化酶StGLO1对模拟水分胁迫的响应

为了解乙醇酸氧化酶在调控植物生长代谢及生物与非生物胁迫过程中发挥的作用。本研究以‘青薯9号’马铃薯为材料克隆乙醇酸氧化酶基因StGLO1,构建过表达载体并转化烟草,观察在干旱胁迫处理下转基因烟草和野生型烟草的长势,并测定了叶片中的游离脯氨酸、CAT、POD的含量以及转基因根茎叶中StGLO1基因的表达量变化,验证过表达StGLO1烟草在干旱胁迫下的响应。结果表明:StGLO1(GenBank登录号XM_006348318.2)基因CDS为1 116 bp,编码371个氨基酸;干旱胁迫下,转StGLO1基因烟草的生长优于野生型,转基因烟草StGLO1基因的表达量在叶片中最高;转基因烟草中的游离脯氨酸、CAT、POD的含量高于野生型,达到差异显著水平(P0.05)。该结果为进一步研究马铃薯干旱胁迫响应机制有一定参考价值,也丰富了马铃薯抗旱育种的基因资源。     

几种单胞藻对火腿许水蚤脂肪酸组成的影响

采用气相色谱分析法测定了几种常用单胞藻及其投喂培养的火腿许水蚤的脂肪酸组成.结果表明,金藻8701和三角褐指藻分别具有较高的DHA和EPA含量,比较适合作为桡足类饵料.金藻8701及其与三角褐指藻、绿色巴夫藻、亚心形扁藻等组合作为混合饵料投喂时,培养的火腿许水蚤的几种重要必需脂肪酸(ARA、EPA、DHA)的含量都较高,其中,以金藻8701和绿色巴夫藻按体积比1∶1作为混合饵料时,火腿许水蚤的DHA/EPA值接近2∶1,更有利于其作为海水仔稚鱼的优质饵料.     

乙酸乙酯对三角褐指藻生长的影响

以三角褐指藻为研究对象,研究了不同质量浓度的乙酸乙酯对其生长的影响。结果表明,在质量浓度低于1.8g/L时,乙酸乙酯对三角褐指藻的生长不产生负面影响,并能提高三角褐指藻的细胞密度和部分脂肪酸的质量分数。其中,细胞密度提高了35%,C18∶0、C18∶2和C20∶5等几种具有经济价值的脂肪酸在总脂肪酸中所占的质量分数分别提高了15.32%,23.15%和31.13%。另外,光合作用活性测定结果表明,加入乙酸乙酯后,三角褐指藻的最大光合作用速率P_max降低、呼吸作用速率R_d增加,这证明了乙酸乙酯是以有机碳源的形式被藻细胞利用,三角褐指藻以混合营养的方式生长。     

衣藻的核基因组转化及外源基因转录分析

通过珠磨法将衣藻表达载体pSP108转入到莱茵衣藻细胞壁缺陷型CC-400藻株中,经抗性筛选及PCR鉴定,获得了24个转化藻株.在抗性基因ble编码序列的中间部位和末端部位分别设计两对不同的探针引物,运用实时荧光定量PCR对转基因藻株进行外源基因转录水平的分析.结果发现:不同转化藻株外源基因的转录水平有明显差异;同一转化藻株两对探针引物,外源基因的转录水平也存在差异.说明莱茵衣藻在转化过程中,外源基因整合到基因组上的片段数量及片段长度和完整性具有不确定性.     

三角褐指藻（Phaeodactylum tricornutum）油脂富集培养的研究

探讨了营养盐铁、硅及植物激素脱落酸(ABA)单因子对三角褐指藻（Phaeodactylum tricornutum）的生长、油脂含量（%干重）及油脂产量的影响.采用光密度值OD450评价微藻的生长状况,以溶剂浸提法提取油脂.结果表明：⑴铁处理组中,铁浓度在0~46.57 μmol/L范围内时,藻的生长速率随铁浓度提高而增大;铁浓度为11.64 μmol/L时,油脂含量达30%,高于其它铁浓度培养;当铁浓度为11.64 μmol/L时,油脂产量最高——是无铁培养的2.8倍; ⑵ 硅处理组中,低含量硅盐（     

乙醇对斜生栅藻叶绿素荧光特性以及油脂积累的影响研究

为了研究乙醇对斜生栅藻(Scenedesmus obliquus XJ002)藻株光合效率以及胞内油脂积累的影响,首先采用酶标仪作为检测仪器,研究了尼罗红终浓度、二甲基亚砜(DMSO)体积分数、尼罗红染色时间对藻株油脂测定的影响,分析了藻株胞内油脂含量与尼罗红染色相对荧光信号强度之间的线性关系,为XJ002藻株胞内油脂含量的测定提供了一个简便、快速的方法.其次研究了不同体积分数的乙醇添加对XJ002藻株生物量、叶绿素荧光特性以及胞内总脂含量的影响.结果表明:XJ002藻细胞尼罗红染色最佳条件是:二甲基亚砜体积分数为2%,尼罗红的终质量浓度为2.0μg·m L~(-1),尼罗红的染色时间为5 min.添加高浓度乙醇导致藻细胞生物量与光合色素含量显著下降,影响了藻细胞光系统Ⅱ反应中心能量分配,抑制光系统Ⅱ反应中心受体侧电子传递活性.当乙醇处理浓度为3%时,XJ002藻株胞内总脂含量较对照组提高了5.19%,该研究表明乙醇可以作为XJ002藻株油脂积累的潜在诱导试剂.