基因编辑技术在绒山羊育种中的应用

近年来,随着基因编辑技术发展的日趋完善,其在猪、牛、羊等家畜育种上的应用日益增多.为全面了解基因编辑技术在绒山羊育种中的研究进展,总结了锌指核酸酶(ZFNs)、转录激活类效应因子(TALENs)和成簇规律间隔短回文重复序列核酸酶(CRISPR/Cas9)三种基因编辑技术的原理和方法,阐述了其在转基因绒山羊研究中的发展现状和应用前景.     

一种新型的构建CRISPR/Cas9 KnockOut载体的方法

利用CRISPR/Cas9系统这一基于细菌核酸酶Cas9的新型基因编辑工具,可以在原核细胞和真核细胞中实现基因敲除的功能.首先使用CRISPR设计工具设计靶点,退火来制备sgRNA双链,用Bsm BⅠ酶切割gRNA质粒,构建Lenti CRISPRv2的重组质粒.通过U6启动子上的LKO1.5引物对每个菌落序列进行了测序验证,结果表明利用此新方法可以成功构建CRISPR/Cas9系统的Knock Out载体.     

新型基因编辑技术CRISPR/Cas9系统研究现状

规律成簇间隔短回文重复序列及其相关系统(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR associated,CRISPR/Cas system)是细菌和古细菌防御外来噬菌体、质粒或其他外源DNA侵染的获得性免疫系统.依据Cas蛋白种类和同源性,CRISPR/Cas系统被分为3类,其中,Ⅰ类和Ⅲ类需要多种Cas蛋白参与,而Ⅱ类系统,即CRISPR/Cas9组成简单,仅需Cas9蛋白参与即可.经过遗传工程改造后的CRISPR/Cas9已经作为一种新型的基因编辑工具被用于多种生物的基因组编辑.本文就CRISPR/Cas9系统的发现、结构组成、作用机制、研究现状、面临的困境及应用前景等几方面进行了总结.     

CRISPR/Cas9基因组编辑新进展

正2016年4月份,美国农业部(USDA)在一封公开函中声明,他们不会对利用CRISPR/Cas9技术得到的基因编辑蘑菇进行监管。这意味着这种蘑菇可以不通过相关机构的监管程序就可以栽培并销售。这是第一种得到美国政府绿灯通行的利用CRISPR/Cas9技术得到的有机体,也是过去5年中不受USDA监管的30种基因改造有机体之一。这30种有机体大多数是植物,其中几种是通过ZFN和TALEN基因编辑技术得到的,而使用CRISPR/Cas9技术得到的作物终于也得到了同样的通行政策。该项目的参与者、中国科学院遗传与发育生物学研究所研究员高彩霞说:"我有信心看到将有更多的基因编辑作物不受管理部门的监管。"     

基因组编辑技术——CRISPR/Cas系统

基因定点编辑技术包括基于胚胎干细胞及同源基因片段重组的基因打靶技术、锌指结构(ZFN)、类转录激活因子效应物(TALEN)以及CRISPR/Cas系统,CRISPR/Cas系统具有操作简单、突变率高、成本低,同时可针对多个基因等优点;该技术可进行定点修饰,如敲除、插入、替换等.目前CRISPR/Cas系统已成功应用到小鼠、人类细胞、线虫、果蝇、斑马鱼、拟南芥、水稻和猴等.文章将对基因修饰技术发展脉络做统一梳理,并将系统阐述CRISPR/Cas系统的原理、应用以及该技术的优缺点.     

CRISPR/Cas9技术联合AAV对Rosa-mTmG小鼠的MEF细胞进行编辑

目前,基因编辑技术已被广泛用于生物医学研究,本研究利用AAV(Adeno-Associated Virus)递送CRISPR/Cas9系统,实现高效率的基因编辑,并对特定组织细胞中的基因编辑进行了初步探索.我们首先采用Rosa-mTmG转基因小鼠来研究CRISPR/Cas9在小鼠胚胎成纤维细胞(Mouse Embryonic Fibroblast,MEF)中的编辑效率;接着,我们构建了能够被AAV包装的SaCas9系统,并通过瞬转以及AAV介导递送的方式检测其基因编辑效率;最后,我们还构建了含有心肌特异启动子的cTNT-PX601-sgRNA以备后续研究.结果发现,与瞬转相比,AAV介导CMV-PX601-sgRNA在体外能够极大地提高细胞的基因编辑效率.另外,cTNT-PX601-sgRNA能够在心肌细胞中特异表达.我们的结果表明,利用AAV介导的CRISPR/Cas9系统在体外可以实现高效地基因编辑,为靶向修复基因缺陷疾病,特别是特定组织器官中的基因缺陷,提供了研究工具和实验依据.     

CRISPR/Cas9核糖核蛋白介导的无T-DNA插入的白桦BpGLK1精准突变

【目的】CRISPR/Cas9 RNP系统是一种高效的基因编辑技术,具有简单、精准等特点,已被广泛应用于动、植物的基因编辑研究中。目前,通过微粒轰击技术将Cas9蛋白和gRNA核糖核蛋白复合体(RNP)导入受体细胞,获得无选择标记的基因编辑植物,该技术的提出为快速创制植物突变体提供了崭新思路。【方法】本研究以白桦(Betula platyphylla×B.pendula)BpGLK1基因为编辑的靶基因,采用CRISPR/Cas9 RNP技术开展无T-DNA插入的BpGLK1基因编辑。在白桦BpGLK1基因的第1外显子处设计靶位点,采用PCR扩增技术获得BpGLK1-E1靶位点片段;采用酶切及连接技术构建pAbAi-BpGLK1-E1重组质粒,将该质粒线性化后与Cas9蛋白作用,体外检测CRISPR/Cas9 RNP活性及gRNA的精准性。以白桦合子胚诱导的愈伤组织为受体,采用微粒轰击技术进行BpGLK1定向诱变。【结果】CRISPR/Cas9 RNP体外活性检测显示：Cas9蛋白及gRNA复合体具有裂解活性,可在BpGLK1靶位点的特定位点进行有效切割。以白桦成熟胚为材料,在无光照条件...     

基因编辑技术在花卉育种中应用的研究进展

相较传统育种,基因编辑育种能够更精准、高效地改变植物的性状,获得优良的品种.目前应用基因编辑技术于花卉育种研究的报道相对较少.该文综述了基因编辑技术,特别是规律成簇的间隔短回文重复/CRISPR-关联核酸内切酶9(CRISPR/Cas 9)在花卉中的研究进展及其局限性,同时还就花卉基因编辑育种的发展方向进行了讨论,希望...     

水稻OsDTH10基因CRISPR/Cas9编辑突变体的创建及功能分析

为了探究OsDTH10基因在水稻生长发育及开花中的作用,利用CRISPR/Cas9基因编辑技术对OsDTH10基因进行定向编辑.在OsDTH10基因的第4个外显子处设计sgRNA的靶位点,通过PCR扩增与Os U6SK空载体连接形成OsU6SK-sg RNA融合载体,再将获得的sg RNA和Cas9连接到植物双元载体pCAMBI1300中,得到重组载体pCAMBI1300-CRISPR/Cas9-OsDTH10.利用农杆菌介导的植物转化法得到转基因植株,对其进行鉴定并测序.本研究共获得3个株系8株转基因植株,测序结果显示,2号株系的4株转基因植株由于发生了单碱基的插入,基因测序出现了套峰.田间表型观察发现,2号株系的4株T0代转基因植株抽穗期早于空载体对照,获得的T1代转基因植株抽穗期比对照的提早8 d.这些结果表明,重组载体pCAMBI1300-CRISPR/Cas9-OsDTH10成功实现了对水稻OsDTH10基因的定向编辑.     

gRNA二级结构对拟南芥HD2基因CRISPR/Cas9编辑率的影响

近年来,利用基因编辑工具编辑特定基因逐渐成为一种获得突变体的主要方法。CRISPR/Cas9编辑技术是目前最新和最高效的基因编辑技术。然而,这一技术在植物中的编辑率受到很多因素的影响,例如如何设计gRNA以及如何避免脱靶效应等。为了探究gRNA的二级结构对拟南芥基因编辑的影响,我们选择了拟南芥基因组中的组蛋白去乙酰化酶(HDACs)基因家族中一个植物特有的亚家族(HD2)为靶基因,通过设计这一亚家族中3个HD2基因不同的CRISPR/Cas9靶点,观察不同gRNA接头二级结构对CIRSPR/Cas9编辑率的影响。结果显示：不同gRNA接头二级结构对基因的编辑率会有一定的影响,当二级结构由一段单链RNA、5个茎环、2个突环和3个发夹环组成的时候,编辑率最高。该研究可为后续人们使用以tRNA为策略设计gRNA的CRISPR/Cas9工具时选择合适的靶点,为提高基因编辑率提供基础。     

靶向c-myc基因的CRISPR/Cas9腺病毒系统对肝癌的抑制作用

目的:设计、构建并包装靶向c-myc基因的CRISPR/Cas9腺病毒;评估靶向c-myc基因的CRISPR/Cas9腺病毒系统对肝癌的抑制作用.方法:采用生物信息学网站设计靶向c-myc基因的gRNA,以GFP作为对照设计GFP gRNA;通过T7E1筛选出编辑效率高的gRNA并将筛选的gRNA构建CRISPR/Cas9腺病毒载体并包装腺病毒,通过分析细胞增殖、周期和凋亡及迁移能力的变化来评估靶向c-myc基因的CRISPR/Cas9腺病毒系统对肝癌的抑制作用.结果:成功设计、构建并包装靶向c-myc基因的CRISPR/Cas9腺病毒;靶向c-myc基因的CRISPR/Cas9腺病毒系统能够显著抑制Hepa1-6细胞的增殖和迁移、阻滞细胞周期进程,但对细胞凋亡无影响.结论:靶向c-myc基因的CRISPR/Cas9腺病毒系统可在细胞水平明显抑制肝癌细胞的生长.     

埃马纽埃尔·卡彭蒂耶、珍妮弗·杜德纳:因CRISPR/Cas9"基因剪刀"而获2020年诺贝尔化学奖的两位女科学家

埃马纽埃尔·卡彭蒂耶和珍妮弗·杜德纳,因合作开发基因编辑技术——CRISPR/Cas9"基因剪刀"而获得2020年诺贝尔化学奖.CRISPR/Cas9技术的低成本、强易用性和高效率,促进了生命科学的突破性发展,也使它拥有了巨大的商业价值.通过回顾两位科学家的科研历程和基因编辑领域的成就,提出了相关的思考和启示.     

埃马纽埃尔·卡彭蒂耶、珍妮弗·杜德纳:因CRISPR/Cas9"基因剪刀"而获2020年诺贝尔化学奖的两位女科学家

埃马纽埃尔·卡彭蒂耶和珍妮弗·杜德纳,因合作开发基因编辑技术——CRISPR/Cas9"基因剪刀"而获得2020年诺贝尔化学奖.CRISPR/Cas9技术的低成本、强易用性和高效率,促进了生命科学的突破性发展,也使它拥有了巨大的商业价值.通过回顾两位科学家的科研历程和基因编辑领域的成就,提出了相关的思考和启示.     

CRISPR/Cas9系统介导的斑马鱼park2基因的定点敲除

作为目前最新、最先进的基因编辑技术,CRISPR/Cas9系统为分子细胞生物学带来革命性发展,以它的简单高效、灵活性以及可实现DNA序列的定向突变而被广泛使用.斑马鱼的park2基因位于第13号染色体上,编码的Parkin蛋白是一个E3泛素连接酶.该基因在斑马鱼中的功能还不清楚.利用CRISPR/Cas9系统,首次在斑马鱼胚胎中实现了park2基因的大片段删除.由于斑马鱼在发育和疾病研究中有很大优势,实现park2基因敲除将有助于将来进一步研究该基因的功能.     

水稻中5个FT-Like家族成员的基因编辑突变体的创建与分析

为了揭示水稻中FT-like亚家族成员的生物学功能,采用CRISPR/Cas9技术对其中的OsFTL4、OsFTL5、OsFTL6、OsFTL7和OsFTL11进行基因编辑.在5个基因的编码区各选择1个靶点构建1个融合的sgRNA表达框,将表达框装载到CRISPR/Cas9表达载体中,通过农杆菌介导的遗传转化法侵染水稻...     

RNA靶向基因组编辑技术CRISPR/Cas9在昆虫中的研究进展

介绍CRISPR/Cas9系统的基本结构、作用机制、脱靶效应以及在昆虫基因编辑和基因功能研究中的应用,并对该技术可能出现的问题及应用前景进行展望,为进一步将该技术应用于非模式昆虫的基因编辑和基因功能研究提供参考.     

CRISPR/Cas基因编辑系统的研究进展及应用

规律成簇间隔短回文重复序列(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)和CRISPR相关蛋白(CRISPR-associated proteins,Cas)组成的CRISPR/Cas系统是古细菌和细菌特有的抵御外源核酸入侵的适应性免疫机制.其中CRISPR/Cas9系统已经在动植物基因功能研究和模型构建等方面得到广泛的应用.另外,CRISPR/Cas系统在基因治疗和核酸分子检测领域的应用也是近年来研究的热点.本文主要对CRISPR/Cas系统的发现、组成和作用机制以及该系统的应用进行综述.     

利用CRISPR/Cas9技术敲除斑马鱼核受体PXR基因初探

孕烷X受体(Pregnane X receptor,PXR)是核受体超家族(NRs)中NR1I的重要成员之一,在保护机体免于内源性和外源性物质损伤方面具有重要作用。利用CRISPR/Cas9基因编辑技术建立PXR基因敲除的斑马鱼模型,为研究环境污染物的毒性机理及代谢过程提供基础模型。根据PXR基因序列,设计gRNA靶位点,体外转录合成gRNA。同时,将设计合成的gRNA与Cas9 mRNA通过显微注射转入斑马鱼受精卵,经孵化、筛选出有效的突变体,并逐代培养杂交筛选出PXR基因敲除突变体。结果表明利用CRISPR/Cas9基因编辑技术成功敲除PXR基因,经测序分析获得稳定的PXR(+4/+4)基因纯合体。     

基于CRISPR/Cas9技术建立敲除Plac9基因的人胚肾细胞株

目的:通过CRISPR/Cas9基因编辑技术和流式细胞术相结合,获得可编辑Plac9基因敲除的人胚肾细胞株(293T).方法:根据Plac9外显子设计了4个sgRNAs(S1,S2,S3,S4),分别将其与PX458载体连接,构建了PX458-S1(S2/S3/S4)载体.通过转染试剂lipo2000将表达载体分别转染至293T细胞中,并以流式细胞术对带绿色荧光蛋白标记的细胞进行单细胞分选,分选后的细胞培养一段时间后,用基因组测序和错配酶酶切进行筛选.从筛选好的细胞中提取蛋白,进行Western Blot检测敲除效率.结果:采用CRISPR/Cas9和流式细胞术结合技术成功构建了Plac9蛋白表达缺失的人胚肾细胞株.结论:该方法简便快捷、效率高,可广泛地用于编辑各种细胞和细胞功能研究.