黑曲霉ATCC1015催化16α,17α–环氧黄体酮11α–羟基化及相关P450基因诱导表达

为了定向遗传改造黑曲霉菌种,研究了黑曲霉(Aspergillus niger)ATCC1015转化甾体16α,17α–环氧黄体酮活性.转化产物经过薄层层析(TLC)、高效液相色谱(HPLC)以及氢谱、碳谱分析最终确定为11α–羟基–16α,17α–环氧黄体酮.确定了黑曲霉ATCC1015 11α–羟基化活性受底物16α,17α–环氧黄体酮的诱导.鉴于真菌的甾体羟化酶属于细胞色素P450酶,从黑曲霉ATCC1015的P450(CYP)基因数据库中筛选出57个具有编码甾体羟化酶潜力的CYP基因;利用实时荧光定量PCR确定了2个受甾体底物高度诱导的候选目标甾体羟化酶基因An A100和An A154.分别构建了An A100基因和An A154基因的重组酿酒酵母菌株p YES2-An A100和p YES2-An A154,甾体转化结果显示重组酵母菌p YES2-An100能够转化16α,17α–环氧黄体酮生成11α–羟基–16α,17α–环氧黄体酮.     

转化左旋乙基甾烯双酮的微生物筛选及转化产物研究

为了满足甾体药物日益增长的市场需求,从南方采集的新鲜树皮中筛选出具有转化新型甾体化合物左旋乙基甾烯双酮活力的微生物米根霉.利用该菌对左旋乙基甾烯双酮进行生物催化,转化产物经纯化、重结晶后,通过单晶衍射鉴定为6,β–羟基–13,β–乙基–4–烯–3,17–二酮和10,β–羟基–13,β–乙基–4–烯–3,17–二酮.通过高效液相色谱对转化过程中的甾体化合物进行分析,发现转化24,h后,底物左旋乙基甾烯双酮、6,β–羟基化产物和10,β–羟基化产物的含量分别为28.4%、32.2%和35.7%.     

增加雷斯青霉15α–羟化酶基因拷贝数提高甾体转化效率

孕二烯酮是第三代高效避孕药的主要成分.雷斯青霉(Penicilliumraistrickii)ATCC10490催化甾体左旋乙基甾烯双酮的C15α–羟基化反应合成孕二烯酮的重要中间体C15α–羟基左旋乙基甾烯双酮.为了提高现有生产菌种的转化效率,本文研究了在雷斯青霉ATCC10490中增加甾体C15α–羟化酶基因(PRH)拷贝数对转化效率的影响.分别构建了PRH基因的诱导型和组成型过表达载体pPZP-p800-PRH和pPZP-TrpC-PRH,并通过同源重组的方法定点整合到雷斯青霉基因组.转化实验表明,在出发菌株中增加一个PRH基因拷贝显著提高了甾体左旋乙基甾烯双酮转化效率,重组菌PRH-P800和PRH-TrpC的摩尔转化率分别提高了13%和20%,同时转化时间均缩短了12 h.     

利用谷氨酸棒杆菌转化法合成4–羟基异亮氨酸

4–羟基异亮氨酸(4-hydroxyisoleucine,4-HIL)具有葡萄糖依赖的促进胰岛素分泌的活性,在L–异亮氨酸(Lisoleucine,L-Ile)生产菌株谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)YILW中过表达来源于苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis)TCCC11826的L–异亮氨酸羟化酶(L-isoleucine dioxygenase,IDO)编码基因ido,以期利用微生物转化法合成4-HIL,并研究α–酮戊二酸(α-ketoglutarate,α-KG)和Fe2+添加量对菌株合成4-HIL的影响.结果表明:构建的C.glutamicum YILW-IDO菌株能够表达出有活性的IDO,并能够利用菌体自身合成的L-Ile以及培养基中的α–酮戊二酸合成4-HIL.此外,α–酮戊二酸和Fe2+均能影响4-HIL的合成,在其添加量分别为40,mmol/L和4,mmol/L条件下,培养50,h,4-HIL产量达(35.7±1.0)mmol/L.本研究可为4-HIL及氨基酸衍生物的生物制造提供理论依据.     

三种真菌对洋地黄毒苷的生物转化特性研究

考察了新月弯孢霉(Curvularia lunata)AS3.3589、蓝色犁头霉(Absidia coerulea)CICC40302和雷斯青霉(Penicillium raistrickii)ATCC10490对洋地黄毒苷的生物转化特性.结果表明:新月弯孢霉AS3.3589转化洋地黄毒苷得到2个产物,即产物Ⅰ和产物Ⅱ,产物Ⅰ的转化率为27%,产物Ⅱ的转化率为5%;蓝色犁头霉CICC40302转化洋地黄毒苷得到1个产物,即产物Ⅲ,转化率为6%;雷斯青霉ATCC10490对洋地黄毒苷不发生转化反应.通过优化新月弯孢霉KA-91生物转化反应的工艺条件,使转化产物Ⅰ的转化率达到38%,产物Ⅱ的转化率达到10%.     

紫红红球菌9α–羟化酶loop对酶活性的影响

3–甾酮–9α–羟化酶是转化雄甾–4–烯–3,17–二酮生成9α–羟基雄甾–4–烯–3,17–二酮的关键酶,其加氧酶组分在底物进入酶活性中心入口处,存在一个由16个氨基酸构成的柔性loop.为了明晰loop对酶活性的影响,利用定点突变技术对loop上结构变化较大的氨基酸进行研究,解析出了各氨基酸的作用,T224、N225、Y226与周围α5螺旋和β折叠存在一定相互作用,共同调节底物通道与底物运送能力;D227和D228起到支撑固定loop结构的作用,使T224–Y226能与其周围的氨基酸产生相互作用.这为进一步采用蛋白质工程改造9α–羟化酶提供了理论依据.     

赭曲霉甾体11α–羟化酶基因AOH在毕赤酵母中的表达及功能分析

11α–羟基左旋乙基甾烯双酮(11α-OH-GD)是生产高效避孕药去氧孕烯的关键中间体.丝状真菌赭曲霉(Aspergillus ochraceus)TCCC41060可以转化左旋乙基甾烯双酮(GD)形成11α-OH-GD,但该转化反应特异性低,副产物偏高,限制了其工业应用.为了研究赭曲霉转化GD特异性偏低的机理,本文克隆了赭曲霉11α–羟化酶基因AOH并构建了表达载体p PIC3.5,K-AOH,获得了重组毕赤酵母菌株.聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)与免疫印迹实验(Western blot)分析表明,AOH重组蛋白相对分子质量为6.12×104,与预测结果一致.对转化产物进行薄层色谱(TLC)和高效液相色谱(HPLC)分析结果显示,AOH重组菌株能够转化GD,形成目标产物11α-OH-GD以及3种副产物.以上结果表明:AOH基因编码的甾体11α–羟化酶对底物GD转化反应的特异性较差.     

杂色曲霉转化孕酮的研究

利用杂色曲霉对孕酮进行生物转化,通过HPLC对转化产物进行检测,硅胶柱层析分离纯化转化产物,得到3个转化产物.运用NMR、MS、IR等波谱数据对转化产物进行结构鉴定,确定转化产物结构为:雄烯二酮(AD);睾酮;雄二烯二酮(ADD).研究结果表明,杂色曲霉菌株能够裂解孕酮C-17位的侧链,生成19个碳的转化产物,并对裂解产物进行结构修饰.     

雷斯青霉NADPH-细胞色素P450还原酶基因的克隆及生物信息学分析

工业上利用丝状真菌雷斯青霉(Penicillium raistrickii)转化生产高效避孕药孕二烯酮的关键中间体15α–羟基左旋乙基甾烯双酮.已知参与雷斯青霉甾体转化反应的关键酶为P450羟化酶,该羟化酶体系由细胞色素P450羟化酶和NADPH–细胞色素P450还原酶(CPR)组成,但有关其15α–羟基化反应的分子基础尚不清楚.根据转录组测序数据库,通过RT-PCR扩增克隆了一个雷斯青霉NADPH-细胞色素P450还原酶基因.该基因的开放阅读框为2,082,bp,编码694个氨基酸的多肽链,预测的蛋白相对分子质量为7.63×104,具有CPR蛋白的典型结构域(FMN结合域、FAD和NADPH结合域).NCBI BLAST结果显示雷斯青霉CPR与意大利青霉(P.,italicum)NADPH–细胞色素P450还原酶具有较高的同源性,一致性为93%.     

合成4–羟基异亮氨酸的大肠杆菌构建及其催化体系优化

4–羟基异亮氨酸具有血糖水平依赖的促胰岛素分泌特性,是治疗糖尿病的潜在新药.将异亮氨酸羟化酶(isoleucinedioxygenase,IDO)编码基因ido于大肠杆菌(Escherichcoli)中表达,获得工程菌株E. colipET-ido.以该菌株为研究对象,建立和优化了其合成4–羟基异亮氨酸的静息细胞催化体系.结果表明:在最佳条件下(静息细胞27 g/L,L–异亮氨酸250 mmol/L,α–酮戊二酸250 mmol/L,FeSO48 mmol/L,VC6 mmol/L,反应温度35℃,pH9.0)反应12 h,4–羟基异亮氨酸产量和转化率分别达到249.6 mmol/L和99.8%,较优化前均提高了34.5%和7.5%.这是目前已报道的生物法合成4–羟基异亮氨酸的最高产量,为推动该化合物的微生物合成奠定了良好的基础.     

利用固定化微生物细胞羟基化左旋乙基甾烯双酮

研究了海藻酸钙包埋法固定化技术在甾体化合物的生物转化中的应用.利用固定化 Penicillium raistrickii 细胞实现对左旋乙基甾烯双酮（13-ethyl-estr-4-ene-3,17-dione）的15α 位羟基化作用,合成了重要的药物中间体15α-羟基左旋乙基甾烯双酮.优化了固定化孢子浓度,固定化孢子接种量,投料浓度,投料时间,转化时间等转化条件.结果表明：在摇瓶发酵生物转化中,固定化 Penicillium raistrickii 细胞可重复利用5次而转化能力没有明显下降.     

双液相体系下对黑根霉C11α-羟基化16α，17α-环氧孕酮的研究

研完了双液相体系下黑根霉对16α,17α-氧孕酮C11α-羟基化的生物转化能力.考察了8种有机溶剂对16α,17α-环氧孕酮和C11α-羟基-16α,17α-环氧孕酮的溶解度的差异,比较了它们对黑根霉细胞毒性的大小.结果表明,乙酸丁酯毒性最小,乙酸丁酯与水双液相体系时转化比较有利,达到了44.2%.同时考察了氧促进剂H2O2和外加电子受体维生素K3对提高该体系转化率的影响,分别提高了8%和6%.     

对称的吡嗪双甾体的简便合成方法

吡嗪双甾体是一类结构复杂的甾体-生物碱杂化体,它们不仅具有独特的化学结构,而且表现出极其显著的抗肿瘤活性.由于此类化合物的天然来源极其有限,所以吡嗪双甾体的应用有待于化学方法合成来实现.该文以甾体类化合物番麻皂甙元(hecogenin)、胆甾醇(cholesterol)、麦角甾醇(ergosterol)、豆甾醇(stigmasterol)等为原料,经羟基氧化及Rubottom氧化得到α-羟基酮甾体衍生物,将所得α-羟基酮与醋酸胺作用,一步合成得到对称的吡嗪双甾体类化合物.利用这种方法制备得到了10个对称的吡嗪双甾体类化合物,其中7个吡嗪双甾体未见报道(化合物7,14,25,26,28,29及35).与文献报道的方法相比,该研究工作简化了对称的吡嗪双甾体类似物的合成方法,为此类化合物的合成及进一步的活性研究打下了基础.     

分枝杆菌Mycobacterium sp.M1甾酮C1,2位脱氢酶活性的研究

分枝杆菌Mycobacterium sp．M1可以有效降解大豆甾醇侧链得到雄甾-4-烯-3，17-二酮（AD）和雄甾-1，4-二烯-3，17-二酮（ADD）。通过该菌株细胞和细胞裂解液对底物AD的转化，表明了该菌株中存在甾酮C1．2位脱氢酶。利用酶活测定中活力高的细胞裂解液可以有效地降解大豆甾醇生成ADD。     

雌甾结构改造的合成——Ⅶ.新法合成邻-羟基雌甾化合物

邻-羟基雌甾化合物是雌甾类物质在体内的主要代谢产物,具有特异的生理活性而女性化作用又减失,对其合成方法与生理活性的研究近年来一直受到广泛的注意。1960年,Fishman等用多步反应合成2-和4-羟基雌酚酮。1973年,Gelbke等用氧化-还原反应合成2-和4-羟基雌甾化合物,产率较低,所用氧化剂[NO(SO_3K)_2]制备困难,性质不稳定,能自发分解爆炸。1974年,专利报道苯甲酰氧自由基法合成2-羟基雌酚酮,可惜此法既未见直接用于2-羟基炔雌醇的类似合成,又难于得到     

雷斯青霉的复壮及水溶性离子液体对其15α-羟基化的影响

针对真菌培养过程中出现的退化问题,对雷斯青霉采用灭菌胡萝卜作为斜面培养基进行了复壮处理,并通过添加水溶性离子液体的方式提高底物的溶解与传递.结果表明:在相同培养条件下,采用胡萝卜复壮后的雷斯青霉羟基化左旋乙基甾烯双酮产15α-羟基化左旋乙基甾烯双酮.选用离子液体[EMIm][EtOSO3]代替有机溶剂作为促溶剂,促溶剂添加量为4%,底物左旋乙基甾烯双酮投料量为5,g/L,投料时间为30,h,转化时间为72,h时的产物转化率最高可达68.1%.     

关于蒙脱土K-10催化的烯丙醇脱水重排和二烯-酮-酚重排机理探讨

研究了胆甾 4 烯 3 醇、胆甾 1,4 二烯 3 醇、苄叉丙醇和胆甾 1,4 二烯 3 酮等物质在蒙脱土K 10的催化下进行的脱水和碳正离子重排过程。胆甾 4 烯 3 醇通过碳正离子重排生成胆甾 3,5 二烯;胆甾 1,4 二烯 3 醇和胆甾 1,4 二烯 3 酮通过碳正离子重排和烷基的迁移而得到芳构化的产物;卞叉丙醇未发生所希望的重排反应而大部分转化成醚;胆甾 1,4 二烯 3 酮经蒙脱土K 10催化得到2种主要产物1 羟基 4 甲基 19 降胆甾 1,3,5(10) 三烯(73%)和3 羟基 1 甲基 19 降胆甾1,3,5(10) 三烯(20%),并对可能的重排路径进行了讨论。     

HP-β-CD 对脂质体和真核细胞通透性的影响

以薄膜水化法制备的阴离子脂质体的平均粒径为(180±2.3)nm,Zeta 电位为–33.9,mV.分别以脂质体中钙黄绿素的泄露量和紫外分光光度法测定蛋白含量,以表征羟丙基-β-环糊精(HP-β-CD)对脂质体和真核微生物蓝色犁头霉(Absidia coerulea)细胞通透性的影响.结果表明:在 HP-β-CD 作用下,两者的通透性变化趋势一致.分析比较 HP-β-CD 作用下的甾体化合物17,а,21-二羟基孕甾-4-烯-3,20-二酮(RS)在脂质体和菌体细胞中的通量变化的相关性,表明脂质体与细胞通量变化的拟合度达到97.9%,相关性显著(P<0.05).由此说明,本研究建立的脂质体制备方法以及获得的脂质体能够模拟真核细胞,应用于真核微生物的生物学研究     

蓝色犁头霉JY-2#的选育与发酵特性

将经过紫外线诱变的蓝色犁头霉原生质体倾注于含有化合物RSA（17α-羟基孕甾4-烯-3，20-二酮-21-醋酸酯）的高渗再生培养基平板上，选育具有RSA抗性的氢化可的松生产菌株。获得60株抗性突变株，其中8株突变株的氢化可的松转化率高于出发菌株。突变株JY-2^#的氢化可的松转化率达81．63％，较出发菌株提高了14．1％。初步研究了突变株JY-2^#在5L发酵罐的转化工艺和转化反应动力学。     

24-亚甲基胆甾-4-烯-3β,6β-二醇的合成

从豆甾醇出发,先合成了胆甾-5-烯-24-酮-3β-乙酸酯(2);再用过甲酸将2的5,6位双键氧化为环氧化物,后者在碱性条件下立体专一地开环得胆甾-3β,5α,6β-三羟基-24-酮(3),用醋酐将化合物3的C3-βOH和C6-βOH乙酰化保护后用亚硫酰氯脱水得胆甾-4-烯-24-酮基-3β,6β-二乙酸酯(4),4在碱性条件下脱去乙酰基得胆甾-4-烯-3β,6β-二羟基-24-酮(5);化合物5通过Wittig反应将C-24羰基亚甲基化得到目标化合物24-亚甲基胆甾-4-烯-3β,6β-二醇1,总产率为26%.合成化合物1的光谱数据与分离得到的天然物完全一致.