Klebsiella oxytoca HP1 adhE基因插入失活法构建产氢重组菌

乙醇是产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca) HP1厌氧发酵产H₂的主要副产物, 每生成1.0 mol的乙醇需要消耗2.0 mol NAD(P)H, 从而降低了H₂的产量. 本研究以编码乙醇脱氢酶系(含乙醛脱氢酶和乙醇脱氢酶活性)的adhE基因为改造目标, 利用同源重组技术获得了以提高产氢为目标的K. oxytoca重组菌. 构建工作包括: 根据adhE基因保守序列框克隆K. oxytoca HP1 adhE基因片段, 以质粒pMHE6为模板进行链霉素抗性基因表达盒的扩增, 表达链霉素抗性的aadA基因片段和adhE基因片段分别与载体pMD18-T相连构建重组质粒, 同源整合质粒pTA-Str的构建, 以链霉素作为筛选标记筛选重组菌. 菌落PCR鉴定结果表明, aadA基因表达盒通过质粒pTA-Str的介导已定点插入K. oxytoca HP1基因组中, 成功地构建了adhE基因部分片段缺失的重组菌. 葡萄糖发酵实验结果表明, 相同发酵条件下, 重组菌比野生菌的产氢量提高了16.07%, 乙醇产量下降了70.47%. 利用基因工程技术提高产氢初步获得成功.     

水稻早衰叶突变体基因psl1的遗传分析和精细定位

植物叶片是最主要的光合作用器官. 作物叶片生长、发育和衰老的分子机理研究与提高作物产量形成密切相关. 利用水稻中花11号经Co⁶⁰辐射产生的早衰叶突变体分别与南京6号和南京11号杂交的F₁及其衍生的F₂群体, 对早衰叶突变体进行了遗传分析和基因定位. 结果表明, 该早衰叶突变体是由一隐性核基因psl1控制, 利用SSR标记把psl1定位在水稻第2染色体上. 利用已经公布的水稻基因组序列, 在该基因附近区域发展了34对新的STS标记, 对psl1进行了精细定位. 以此为基础, 构建了覆盖psl1区域的BAC重叠群, 并把目标基因定位在一个约48 kb 的区段上, 为最终克隆目标基因奠定了基础.     

大豆GmLls1基因的克隆及表达调控分析

玉米的叶片坏死斑点(lethal leaf-spot 1, Lls1)基因及其拟南芥中的同功能基因已证明编码叶绿素分解代谢中的关键酶脱镁叶绿酸氧化酶(pheide a oxygenase, PaO). 为了深入研究大豆叶片衰老过程中叶绿素分解代谢的调控机制, 从大豆中克隆了玉米Lls1的同源基因, 其cDNA全长1817 bp, 命名为GmLls1 (GenBank登录号: DQ154009). 序列分析表明, 该基因与拟南芥、玉米、豇豆和番茄等的Lls1及其同功能基因具有很高的同源性, 其编码蛋白含有典型的Rieske [2Fe-2S]结构域、非亚铁血红素铁结合域和C-末端CXXC基序, 这些都是PaO功能蛋白所具有的典型结构特征. RT-PCR结果显示, 在大豆叶片自然衰老、人工黑暗诱导衰老和子叶衰老3个系统中, GmLls1基因都表现出明显的衰老上调趋势. 进一步分析发现, 在因敲减类受体蛋白激酶rlpk2基因而导致衰老延缓的大豆转基因叶片中, GmLls1的表达显著下降, 而在因过表达rlpk2而导致加速衰老的转基因叶片中, GmLls1的转录本积累明显增加, 暗示RLPK2介导的信号途径可能参与调控GmLls1在大豆叶片衰老过程中的表达, 而rlpk2-RNAi转基因离体叶片光照下表现出lls1突变体典型的斑状失绿坏死表型则进一步支持了上述推论.     

一种基于电化学发光技术的高灵敏度PS-1基因点突变检测方法

电化学发光(electrochemiluminescence, ECL)分析是20世纪90年代初发展起来的一种高灵敏度检测方法, 它将电化学法和化学发光法巧妙结合, 利用金属钌的复合物和三丙胺在电极表面发生氧化还原反应而产生高效、连续、稳定的发光, 具有灵敏、快速、准确、操作简便和分析适应性广等特点, 已被应用于核酸的定量分析之中. 将电化学发光技术应用于基因点突变检测, 采用了一种基于PCR技术和限制性内切酶技术的电化学发光分析方法检测Presenilin-1基因(简称PS-1基因)密码子235处发生的点突变. 结果显示, 在PCR循环次数相同的条件下, 野生型样品酶切前后的电化学发光信号强度基本保持不变; 突变型样品酶切前后的电化学发光信号强度变化显著. 该方法可明显区分野生型样品和突变型样品, 可望用于老年性痴呆病的早期诊断.     

水稻花药发育相关基因OsPRP1的克隆和特性分析

利用减法杂交和RACEs从水稻颖花中克隆了一个编码富含脯氨酸残基多肽的cDNA, 并将其相应的基因命名为OsPRP1. OsPRP1由2个外显子和1内含子组成, 编码的蛋白由224个氨基酸残基组成, 其中脯氨酸含量最高, 占14.29%. 该蛋白由一个21个氨基酸残基组成的信号肽, 一个N-端结构域和一个C-端结构域组成. C-端含有2个18个氨基酸长的、嵌合PEPK基元(motif)的富含脯氨酸的重复序列. Southern blot及序列分析结果表明, 水稻基因组中存在4个拷贝的OsPRP1, 它们定位在第10染色体的20 kb的DNA片段上. RT-PCR表明, OsPRP1在幼芽和颖花中表达量较高, 在根和叶中有少量表达. 用花和幼芽进行原位杂交分析证明在花中, OsPRP1在花粉母细胞、绒毡层细胞和花器官的维管束细胞中表达; 该基因的表达有明显的时间特异性, 在花粉母细胞中表达量最高, 在单核期的小孢子中几乎不表达; 在芽中, 该基因在胚芽鞘和叶原基的表皮细胞中表达. 从该基因编码蛋白的特点可以看出它极可能是一种细胞壁蛋白.     

一个新的水稻卷叶突变体rl9(t)的遗传分析和基因定位

对水稻中调控形态发育的基因进行发掘和研究是进行水稻株型改良和植物生长发育分子生物学研究的重要基础研究工作. 本研究在粳稻中花11中鉴别了一个新的卷叶突变体, 并对其进行了遗传分析和基因定位. 结果表明, 该卷叶突变体是由一隐性单位点(rl_9(t))控制, 利用SSR标记已经把Rl_9(t)定位在水稻第9染色体上. 利用已经公布的水稻基因组序列, 在Rl_9(t)附近区域发展了30个新的STS标记, 对Rl_9(t)进行了精细定位. 以此为基础, 构建了覆盖Rl_9(t)区域的PAC重叠群, 并把目标基因定位在一个约42 kb 的区段上, 为最终克隆目标基因奠定了基础.     

根癌农杆菌介导的Cry1A(b)基因在木霉菌中的转化

根癌农杆菌介导的遗传转化是植物基因工程中常规方法，利用这一转化方法，我们成功地将CryⅠA(b)基因转入生防真菌哈茨木霉中，转化率约为60~180个转化子/10⁶个孢子 。通过对转化子的RT-PCR检测和Southern 杂交分析表明，CryⅠA(b)基因已整合进哈茨木霉菌基因组中，而且在转录水平上得到表达。转化子都能够稳定遗传。对转化子抑菌活性和杀虫活性测定表明，转化子不但保持了原菌株良好的抑菌活性，而且表现出一定的杀虫效果。兼有杀虫防病双重作用的基因工程哈茨木霉菌的构建显示了生物技术在生防真菌遗传改良中的应用潜力。     

大丽轮枝菌毒素对棉花悬浮细胞NO和H2O2的产生和GST基因表达的影响

一氧化氮(NO)和过氧化氢(H₂O₂)是重要的信号分子, 参与调控植物的各种生理过程, 特别是在诱导植物防卫基因表达中有重要作用. 本文主要研究NO和H₂O₂是否参与棉花抗大丽轮枝菌毒素(VD-toxins)的抗性反应以及其对GST基因表达的调控作用. 结果表明, NO和H₂O₂信号参与棉花细胞抗大丽轮枝菌毒素的信号途径, 从而诱导抗性反应. NO和H₂O₂信号可能协同作用, 但不相互依赖. GST基因在棉花悬浮细胞抗大丽轮枝菌毒素抗性反应中起重要作用. NO对GST基因表达的调控不依赖H₂O₂, H₂O₂对GST基因表达的诱导作用更强.