根癌农杆菌介导的马铃薯遗传转化体系

随着分子生物学研究的深入,植物功能基因组研究以及后续的大规模基因工程都必将依托于高效的植物遗传转化体系,因此植物遗传转化体系越来越成为分子生物学研究和遗传改良的重要技术基础．农杆菌介导转化法被认为是最具发展潜力的植物遗传转化方法．本文介绍了根癌农杆菌介导的马铃薯遗传转化体系．     

根癌农杆菌介导的马铃薯遗传转化体系的研究

以重庆主栽品种的叶片和茎段为外植体,研究了不同转化条件(菌液浓度、感染时间、预培养及共培养时间)对转化效率的影响,以及选择压和培养基对抗性愈伤出芽的影响,初步建立了马铃薯品种"台湾红"和"Spunta"的遗传转化体系并获得了转化植株.     

根癌农杆菌介导的水稻遗传转化

以粳稻、空育131、垦鉴稻7号成熟胚、幼胚诱导的愈伤组织为材料,将反义蜡质基因导入受体材料.经两次抗性筛选后,转入分化培养基中分化培养后获得转基因小苗.成熟胚和幼胚的转化效果比较,幼胚优于成熟胚.将转化植株进行PCR鉴定,证明外源目的基因已经整合到植株中.     

AgNO3对根癌农杆菌介导的甘薯遗传转化的影响

以甘薯优良栽培品种“南薯88”为试材,研究了AgNO3对根癌农杆菌介导的甘薯遗传转化的影响。结果表明,在预培养的培养基附加AgNO3不利于进行转化,而在共培养培养基中附加AgNO3则对转化有促进作用。当培养基中AgNO3的浓度为6mg/L时,卡那霉素抗性芽的获得率达最大值,为27．5％。文中还对AgNO3在甘薯遗传转化中的作用方式及在建立较简便、高效的甘薯遗传转化系统中的应用进行了讨论。     

根癌农杆菌介导的木霉插入转化及其应用

根癌农杆菌介导的遗传转化法(ATMT)已广泛地应用于真菌的转化研究,该方法具有操作简单、转化效率高和转化子遗传稳定等特点。木霉作为土传植物病原菌的重要生防真菌,对其生防分子作用机制方面的研究也越来越受到关注,目前所面临的问题是如何基因突变和基因替换。ATMT法为木霉(Trichodermaspp.)的分子生物学研究提供了一个强有力的工具,在木霉的插入突变、遗传转化以及基因标记和克隆方面起着重要的作用。本文综述了根癌农杆菌介导木霉遗传转化的原理、特点、转化方法和应用,并且对有关发展趋势进行了展望。     

影响根癌农杆菌介导的香蕉基因转化早期的主要因素

用含质粒载体pCAMBIA2301的根癌农杆菌（Agrobacterium inoculation）转化“641”香蕉（Musa AAA Cavendish subgroup cv.64-1）的薄片外植体，通过测定GUS基因瞬时表达率，对转化早期的主要影响因素进行了研究。结果表明：农杆菌EHA105较适合于介导转化，将薄片置于固体高渗培养基上培养4h后，通过真空减压法使农杆菌接种于其上，获得了较高的瞬时表达率（41.67%），是对照（8.33%）的5倍，农杆菌悬液稀释5倍用于转化较好，共培养3d为宜，薄片外植体越靠近根部，瞬时表达率越高。而外植体预培养会降低瞬时表达率。     

根癌农杆菌介导的百脉根遗传转化体系的优化研究

百脉根(L otus corn icu la tus L.)是世界著名的多年生优良豆科牧草之一,也是常见的庭院观赏植物.本文通过比较不同根癌农杆菌转化百脉根的效率和优化百脉根子叶遗传转化的条件,建立了一套有效的遗传转化体系.实验结果表明,EHA 105作为宿主菌对百脉根进行转化较LBA 4404和GV 3101具有更高的转化率;5 d苗龄的子叶最适合作为转化的外植体;浸染过程中0.05 M Pa负压处理5 m im以及在共培养培养基中添加20 m g/L的乙酰丁香酮均可提高转化效率.卡那霉素抗性植株经3次选择继代培养后,PCR检测全部为阳性.对部分PCR阳性植株进行PCR-Sou thern杂交,证实PCR产物真实可靠,表明外源基因已整合进入百脉根基因组中.     

根癌农杆菌介导的丝状真菌简青霉遗传转化的研究

利用根癌农杆菌LBA4404介导,建立了丝状真菌简青霉(Penicillium simpli-cissimum)H5的遗传转化系统.潮霉素抗性筛选、PCR和Southern blot分子鉴定等结果表明:筛选获得的转化子能够稳定遗传,外源的T-DNA以单拷贝随机整合到简青霉的基因组中.实验初步研究了农杆菌浓度、乙酰丁香酮浓度和共培养时间等因素对转化效率的影响,经过优化后转化体系的效率可达50个转化子/105个孢子.农杆菌介导的遗传转化方法在简青霉上的运用,将为研究该菌的基因工程改造提供强有力的工具.     

根癌农杆菌对黄瓜和朱顶红的转化

用携带有构建质粒Ｃｏ１８的根癌农杆菌（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）菌株ＧＶ３１１－ＳＥ转化双子叶植物黄瓜子叶和单子叶植物朱顶红鳞叶，得到了抗卡那霉素的黄瓜植株和朱顶红愈伤组织，并测出了ＮｐＤＨ活性，证明构建质粒Ｃｏ１８所携带的外源基因转移进了这两种植物细胞并得到了表达。     

提高农杆菌介导小麦遗传转化效率的几个因素

利用gua基因的瞬时表达研究了农杆菌介导的小麦遗传转化,探讨了影响转化效率的几个因素．结果发现,当转化时茵液浓度的OD600为1．0、侵染时间为1h、超声波处理30s、共培养期间使用抗氧化剂以及用胚性愈伤组织作为外植体等,均可使转化效率得到明显提高、综合使用这些优化的转化条件,可使小麦的瞬时转化效率提高3倍多．     

影响农杆菌介导的辣椒基因转化因素的研究

试验设置农杆菌类型、辣椒基因型、外植体、vir基因活化培养基、方法5个因素，研究了利用根癌农杆菌介导法辣椒遗传转化的效果。以获得Km抗性芽外植体频率为指标，发现农杆菌菌株类型和辣椒基因型对转化效率都有较大影响，直接影响着转化效率。采用预培养2d的子叶外植体，用农杆菌侵染5～7min，可获得最高的转化效率。     

根癌农杆菌电击转化条件的研究

探索了根癌农杆菌EHA105的高效转化方法.将双元载体质粒pBIN19/glgB经电击转化法导入根癌农杆菌EHA105,研究不同实验条件对转化率的影响.结果表明:在细胞浓度OD600为1.0时进行电转化,转化率最高,达到每微克DNA1.12×105CFU;当电场强度为11 kv/cm,转化率最高,达到每微克DNA1.78×105CFU;在一定的细胞浓度范围内,电击转化率与细胞浓度密切相关,转化率随着细胞浓度的上升而上升;质粒大小能影响电击转化率,转化率随着质粒的增大而下降.应用该优化的电击转化条件将双元载体质粒pBIN19/glgB成功导入根癌农杆菌EHA105,构建了植物双元表达载体.     

根癌农杆菌的高效电激转化

利用电激法双元载体质粒ｐＢＩ１２１导入根癌农杆菌ＡＧＬ－１并获得较高转化效率。探讨了不同电激条件对转化效率的影响，并检测了ＣａＭＶ３５Ｓ启动子ＧＵＳ基因在根癌农杆菌中的表达。     

影响根癌农杆菌转化水稻频率的因素研究

根癌农杆菌与来自水稻成熟种子的愈伤组织共培养,将外源基因导入水稻愈伤组织,并获得了转基因植株．通过比较影响根癌农杆菌转化频率的各种因素,表明在转化过程中酚类化合物和单糖的加入使农杆菌的转化频率提高了０．９％～１７．４％．在共培养时农杆菌的稀释方式也是影响农杆菌转化频率的重要因素     

根癌农杆菌介导的向日葵遗传转化的研究

以向日葵无菌苗的子叶节为外植体,通过农杆菌介导法,对其遗传转化条件进行了研究,建立了向日葵子叶节农杆菌介导的遗传转化体系.结果表明:在农杆菌浸染前(浸染浓度为OD600=0.6)进行2 d的预培养、浸染8 min的外植体在MS+1.2 mg/L 6-BA+0.03 mg/L IAA的培养基上转化效率较高.PCR检测初步证明,LycB基因已整合到向日葵再生植株中.     

乙酰丁香酮对根癌农杆菌介导的甘薯遗传转化的影响

研究了乙酰丁香酮 (AS)对根癌农杆菌介导的甘薯离体遗传转化的影响 .结果表明 :①菌液中加入AS不利于遗传转化 ;②AS的作用效果与培养基的 pH值有关 .培养基的 pH值为 5 8时 ,加入AS不能提高转化频率 ;而pH值为 5 2时 ,加入AS则能显著提高转化频率 ,特别是AS浓度为 2 5mg·L-1时 ,Kanr 芽获得率提高到 35 7%;③茎段外植体切口两端各滴加 2 μL 2 0 0 μmolL-1的AS ,可使Kanr 芽获得率达 13 3%.     

根癌农杆菌介导的玫瑰茄细胞遗传转化

以玫瑰茄无菌苗的子叶和下胚轴为受体材料,农杆菌LBA4404和EHAl05为供体菌株,对玫瑰茄细胞外植体遗传转化的基本条件进行研究,建立了一个高效的玫瑰茄细胞遗传转化体系．利用这一转化体系获得了2个稳定表达新霉素磷酸转移酶活性的玫瑰茄转化细胞系．β-葡萄糖苷酸酶活性的组织化学检测和PCR扩增鉴定的结果表明,外植体总转化率达29．4％．试验结果还显示农杆菌LBA4404菌株较适合玫瑰茄外植体的转化,转化时不需添加乙酰丁香酮．     

农杆菌介导的唐菖蒲遗传转化体系的建立

在唐菖蒲‘Advanced Red’胚性愈伤组织受体系统的基础上,建立其遗传转化体系。采用根癌农杆菌（GV3101）介导法,研究了侵染液浓度、侵染时间、乙酰丁香酮（AS）浓度、负压和筛选方式等因子对唐菖蒲遗传转化效率的影响。结果表明：在遗传转化过程中,不经预培养,负压处理下,农杆菌菌液OD600为0.6～0.8,侵染时间15～20min,添加100μmol/L AS,共培养3d,可获得较高的遗传转化效率。经过3～4个月选择培养,部分抗性植株经PCR和Southern杂交检测表明,目的基因gus已整合到唐菖蒲基因组中。     

农杆菌介导转化豆科牧草百脉根影响因子

对农杆菌介导转化豆科牧草百脉根的相关影响因子进行了实验研究,结果表明:在百脉根农杆菌转化体系中,以农杆菌AGL1菌株、子叶转化受体、3 d共培养时间以及25 mg/L卡那霉素筛选质量浓度为最佳转化条件.研究还发现,头孢霉素对农杆菌AGL1菌株的抑制作用要强于羧苄霉素.     

根癌农杆菌介导的异角状拟盘多毛孢菌转化系统研究

以携带潮霉素B磷酸转移酶抗性基因(hph)的pBHt1作为转化载体,根癌农杆菌AGL-1作为转化介体,实施转化异角状拟盘多毛孢菌。研究发现,异角状拟盘多毛孢菌的最优转化体系为:异角状拟盘多毛孢菌分生孢子悬浮液浓度为1×106个/mL,根癌农杆菌OD600为0.3,共培养时间48 h,共培养温度为25℃,诱导培养基中乙酰丁香酮(AS)浓度为200μmol/L,选择培养基添加250μg/mL潮霉素B、250μg/mL头孢噻肟钠。1×106个异角状拟盘多毛孢菌分生孢子可以产生200～300个转化子,随机挑选10个转化子进行PCR检测,均能扩增出预期条带,且在不含潮霉素B的PDA培养基平板上转化子连续培养5代后,hph基因仍能稳定遗传,这表明T-DNA已经插入到异角状拟盘多毛孢菌的基因组中。此次建立的异角状拟盘多毛孢菌的转化体系可为该病菌的功能基因研究和寄主与病原菌的互作研究提供有效的工具。