结核分枝杆菌耐链霉素与rpsL和rrS基因的相关性研究

为探讨新疆地区结核分枝杆菌对链霉素(streptomycin,STR)产生耐药性的分子机制,建立直接快速检测结核杆菌STR药物敏感性的方法.应用聚合酶链反应-单链构象多态性(PCR-SSCP)银染分析技术,检测62株结核杆菌临床分离株链霉素耐药性及rpsL和rrS基因变异情况,以结核分枝杆菌标准株(H37Rv)为对照.结果发现62株结核杆菌临床分离株中,32株STR敏感株的rpsL和rrS基因未见SSCP泳动异常,30株STR耐药株中,23株(76.7%)中rpsL(21株)和rrS(5株)基因出现SSCP泳动异常,并且3株出现了rpsL和rrS双基因的SSCP泳动异常.因此,rpsL和rrS基因突变可能是结核分枝杆菌对链霉素产生耐药性的重要分子机制,PCR-SSCP银染技术可作为快速检测结核杆菌STR药物敏感性的方法.     

结核分枝杆菌耐药检测进展

目前全球结核病发病率明显回升,其中耐多药(MDR)结核是本病上升的主要原因之一。对结核分枝杆菌的耐药性检测方法从细菌学方法、噬菌体扩增法、基因检测、变形高压液相色谱、发光技术等方面的进展进行了概述。     

RP-HPLC法测定盐酸乙胺丁醇片的含量

目的:建立反相高效液相色谱法测定盐酸乙胺丁醇的含量.方法:采用ZORBAX SB-C18(4.6mm×150mm,5μm)色谱柱,流动相为A(乙酸铵和乙酸铜的缓冲液用冰醋酸调节pH=5.0):B(甲醇)=83:17;柱温25℃;检测波长270nm;流速1.0ml·min-1;进样体积10μl.结果:盐酸乙胺丁醇浓度在14.40～720.0μg·ml-1范围内,线性关系良好(r=0.999 9 n=6),平均回收率98.88%,s为1.57%.结论:该法准确,灵敏,快速,适用于盐酸乙胺丁醇片含量的控制.     

四川地区利福平耐药结核分枝杆菌rpoB基因利福平耐药决定区突变分析

本文对268株结核分枝杆菌临床分离株(包括213株利福平耐药株、55株利福平敏感株)rpoB基因RRDR区进行测序并比较分析.结果表明,在213株利福平耐药株中有200株(93.90%)在rpoB基因RRDR区发生了突变,在55株利福平敏感株中RRDR均未发生突变.突变频率最高的类型依次为:531位点(55.87%),526位点(16.43%),516位点(10.33%)和511位点(8.92%),以上四个位点的突变菌株数占所有利福平耐药株的91.55%.四川地区利福平耐药株中511位点突变频率高于全国其他地区.     

结核分枝杆菌的抗逆性与致病性研究进展

结核病是由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)复合群感染导致的人畜共患传染病,在新型冠状病毒感染暴发前是全球死亡人数最多的单一传染病。结核病致死率高,主要原因是其致病菌结核分枝杆菌具有极强的毒力且可以抵御多种外界环境胁迫因子。本文主要介绍结核分枝杆菌对理化胁迫的耐受性,以及结核分枝杆菌的耐药性、致病性与免疫性,为深入研究结核病的发病机制和研发新型的抗结核药物提供理论指导。     

结核分枝杆菌mpt64基因稳定表达细胞系的建立

为建立稳定表达结核分枝杆菌分泌蛋白MTP64的P815细胞系,将mpt64基因克隆到真核表达载体pcDNA3.1(-),构建mpt64真核表达载体.重组质粒酶切鉴定正确后,以Lipofectamine2000转染P815细胞,通过G418筛选后,得到阳性克隆,分别以RT-PCR方法检测mRNA表达,间接免疫荧光和Western-blot检测目的蛋白的表达.表达结核分枝杆菌分泌蛋白MPT64的真核表达载体转染细胞后,RT-PCR可扩增出目的基因片段,转染细胞间接免疫荧光检测阳性,Western-blot检测在约26 kDa处有特异显色条带,证实转染细胞表达目的基因.成功地建立mpt64稳定表达细胞系,为进一步结核疫苗评价奠定一定基础.     

ICP-AES比较临床分离药物敏感和耐药结核分枝杆菌的金属离子

利用现在多元素痕量分析最重要的方法——电感耦合等离子体原子发射光谱(ICP—AES)分析结核分枝杆菌中的金属离子的种类和含量,结果表明,Cr^3 ,Al^3 ,Ca^2 ,Fe^2 ,Mn^2 ,Co^2 ,Cu^2 ,Ni^2 的含量较高,并发现药物敏感菌株和耐药菌株之间在金属离子种类和含量上有明显区别．这种差异在耐药中的意义有待进一步研究．     

结核分枝杆菌诊断抗原的研究进展

结核病的血清学诊断是一种敏感、特异、快速、低成本的检验方法,而所用诊断抗原的特异性、敏感性与诊断符合率密切相关。本文就目前在研的几种结核分枝杆菌诊断抗原(结核菌素、38 kD蛋白、ESAT-6、MPT64、M tb8.4、A-60、LAM、TB4)作一简要综述。     

液相芯片快速检测结核耐药基因方法建立

基于Luminex100^TM技术平台,结合多重PCR技术,以5’生物素标记引物为信号指示,在H₉37)RV结核标准株做对照下,对104株结核分枝杆菌分离株的LFP耐药rpoB基因和INH耐药的katG,inhA基因进行检测,并与药敏试验绝对浓度法和测序结果比较.结果表明:液相芯片检出结果与药敏法比较,104株分离株中LFP、INH、多重耐药的检出结果分别为:液态芯片检测73株、50株、48株;药敏检测结果为74株、58株、53株;对比检出率98.6%,86.2%,90.6%.液相基因芯片技术对耐药,耐多药结核的检测,具有特异性高,敏感性强的特点,是检测结核分枝杆菌耐药基因的有效方法,可用于临床检测.     

结核分枝杆菌HSP65-hIL-2融合基因稳定转染细胞系的建立

建立可稳定表达结核分枝杆菌HSP65-hIL-2融合蛋白的稳定转染P815细胞系. 在阳离子脂质体作用下,将HSP65-hIL-2真核表达质粒转染与BALB/c 遗传背景一致的P815细胞(H-2d).G418筛选阳性克隆,RT-PCR和间接免疫荧光法检测目的蛋白的转录和表达. 阳性克隆细胞经RT-PCR检测到HSP65-hIL-2融合基因特异性的mRNA表达;用鼠抗人的IL-2 mAb进行间接免疫荧光检测,可在转染的P815细胞浆中观察到较强的绿色特异性荧光,而未转染细胞则为阴性.成功获得稳定表达HSP65-hIL-2融合蛋白的稳定转染细胞系,为其疫苗的CTL研究提供了合适的靶细胞.     

西藏拉萨地区198株结核分枝杆菌耐药性分析

目的：了解拉萨地区结核分枝杆菌对抗结核药物的耐药情况,为临床合理用药提供参考依据。方法：采用WHO推荐的比例法对分离自西藏拉萨地区肺结核患者的198株结核分枝杆菌进行4种抗结核药物（RFP、INH、SM、LVX）的药物敏感性试验。结果：198株结核分枝杆菌中耐药菌株有125株,总耐药率为63.1%（125/198）,总耐多药率为29.8%（59/198）,初治耐药率为55.1%（64/116）,复治耐药率为75.4%（40/53）,初治耐多药率为20.7%（24/116）,复治耐多药率为56.7%（30/53）。对RFP、INH、SM、LVX的耐药率分别为36.3%（72/198）、41.9%（83/198）、41.4%（82/198）和7.0%（14/198）。结论：西藏拉萨地区临床结核分枝杆菌耐药情况较为严重,应加强临床结核分枝杆菌耐药性监测,指导临床用药以防控耐药菌的产生。     

绵羊褪黑激素受体1a基因第二外显子的多态性分析

采用2种限制性内切核酸酶MnlⅠ和RsaⅠ对常年发情的湖羊以及季节性发情的中国美利奴羊、罗米丽羊、罗米丽（Romilly Hills）×中国美利奴（新疆军垦型）褪黑激素受体1a（MTNR1A）基因外显子2的824bp扩增产物进行PCR-RFLP分析。结果表明：MTNR1A基因外显子2的在605位碱基处表现出MnlⅠ酶切多态性,在604位碱基处表现出RsaⅠ酶切多态性。χ^2适合性检验结果表明4种绵羊MTNR1A基因第二外显子在RsaⅠ和MnlⅠ酶切位点上都达到Hardy-Weinberg平衡状态（P〉0.05）;4种绵羊在RsaⅠ和MnlⅠ酶切位点上各基因型的分布通过χ^2独立性检验,结果表明差异极显著（P〈0.01）。     

尘肺结核患者Mycobacterium tuberculosis耐药基因突变研究

研究尘肺结核患者结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)耐药基因突变与耐药性的关系。在97例尘肺结核患者痰中检出MTB菌株28株,采用PCR-SSCP法检测katG、rpoB和rpsL基因突变,并与采用常规药敏试验(AST)法检测的耐药结果进行对比分析。采用PCR-SSCP法检测katG、rpoB和rpsL基因,突变率分别为42.86%(12/28)、42.86%(12/28)和32.14%(9/28),采用AST法检测INH、RFP和SM,耐药率分别为64.23%(18/28)、60.71%(17/28)和53.57%(15/28),两者之间差异均无显著性(P>0.05)。其中多耐药株20例(71.43%),包括耐三种药物12例(42.86%),耐两种药8例(28.57%),单耐药株6例(21.43%),敏感株2例,耐药率92.86%。PCR-SSCP法检出3个基因联合突变8株,与AST法符合率为66.67%(8/12);2个基因突变5株,符合率为62.50%(5/8);单基因突变2株,符合率为33.33%(2/6)。结果表明:PCR-SSCP技术适用于MTB katG、rpoB和rpsL耐药基因突变的筛选,对指导尘肺结核患者临床用药上具有重要意义。     

玫瑰冠鸡IGF-1基因多态性与早期生长速度关系研究

以玫瑰冠类群鸡(玫瑰冠鸡)为材料,采用PCR-RFLP法检测了IGF-1基因5’调控区DNA序列多态性,并运用线性模型统计方法分析了多态性与初生重和12周龄体重的关系。结果显示:玫瑰冠鸡IGF-1基因5’调控区自然存在两种不同DNA序列,经PstI酶切后出现3种基因型("-/-"、"-/ "、" / "),基因型分布符合哈代-温伯格定律。各基因型个体的初生重、12周龄体重的最小二乘均存在"-/-">" /-">" / "的趋势,且"-/-"型个体的12周龄体重显著高于" / "型个体(P<0.05)。     

结核杆菌ESAT-6基因疫苗对结核杆菌感染小鼠的免疫保护效果研究

为研究结核杆菌ESAT-6基因疫苗的免疫原性及对小鼠结核杆菌感染的免疫保护效果,将雌性C57BL／6N小鼠32只,随机分为4组,即结核杆菌ESAT-6基因疫苗组、BCG组、pcDNA3．1（＋）组和PBS组。取小鼠脾细胞培养上清检测细胞因子水平;并按效靶比例分别为100：1、50：1、10：1进行CIL杀伤活性检测。用结核杆菌H37Rv国际标准强毒株静脉注射攻击小鼠,计数肺和脾组织中的结核杆菌菌落数,对小鼠部分肺和脾组织作病理切片,HE染色观察组织病变程度,Z—N染色检查抗酸杆菌,观察陔疫苗对小鼠结核杆菌感染的免疫保护效果。结果表明,结核杆菌ESAT-6基因疫苗对小鼠结核杆菌感染有一定的免疫保护效果,可诱导较强的抗原特异性Th1型细胞免疫应答,细胞因子IFN-γ和IL-1分泌增加,IL-4分泌减少,CTL特异件活性增加;使小鼠肺和脾组织中的结核杆菌菌落数较空载体组显著减少,组织病变明显减轻。     

结核分枝杆菌特异性抗原的N末端氨基酸序列分析

把ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔ分析抗原抗体反应的高度特异性与ＰＶＤＦ膜作为载体进行蛋白质氨基酸序列分析的高度敏感性相结合对结核分枝菌的特异性抗原表位刊物筛选和分析鉴定,获得了一个分子质量为３１ｋｕ,Ｎ末端为ＡｌａＧｌｕＶａｌＡｓｐＬｅｕＶａｌＰｈｅＡｌａＶａｌＳｅｒＴｒｐＰｒｏＶａｌＧｌｙ的结核分枝杆菌抗原。     

结核分枝杆菌HSP65-IL-2融合基因疫苗的构建及表达

构建结核分枝杆菌HSP65-IL-2融合基因疫苗,并对其在体外真核细胞中进行表达。用EcoRV和Hindm双酶切合HSP65-IL-2融合基因的pPaO-hsp65-IL-2载体,回收目的基因片断HSP65-IL-2,并将其亚克隆入同样双酶切的真核表达载体pcDNA3．1（-）中,重组质粒酶切鉴定正确后以脂质体瞬时转染COS-7细胞,并通过间接免疫荧光技术检测目的蛋白的表达。重组真核表达质粒酶切后可获得约2067bp的融合基因HSP65-IL-2片段,间接免疫荧光检测重组质粒转染的COS-7细胞,可在细胞胞浆中看到特异性的绿色荧光。成功地构建了结核分枝杆菌HSP65-IL-2融合基因的真核表达载体,且该重组载体可在体外真核细胞中获得特异性的表达。     

荔枝R基因同源序列的克隆与分析

根据已知植物抗病基因（R基因）编码的蛋白质NBS保守区设计特异简并引物，对荔枝的基因组DNA进行体外扩增，获得了一条大小约500bp的扩增谱带；回收该特异扩增带并进行克隆，筛选若干阳性克隆进行测序，共获得5个片段的序列。同源性比较发现，该5个片段均属于NBS－LRR类抗病基因同源序列（RGA），与已知R基因相应区段的氨基酸序列一致性为13.5%-45.9%。这些RGA既可进一步用于筛选荔枝的抗病候选基因，同时也可以作为分子标记，用于荔枝遗传图谱的构建。该研究表明R基因同源克隆技术可望成为荔枝抗病基因克隆和基因组研究的重要手段。     

结核分枝杆菌单克隆抗体与自身抗原组蛋自的免疫交叉反应研究

WesternBlot实验证实了结核分枝杆菌（Mycobacteriumtuberculosis）H37Ra的单克隆抗体与自身抗原组蛋白发生免疫交叉反应．利用计算机软件对交叉反应的分子生物学基础进行了分析,发现结核分枝杆菌H37Ra的蛋白与组蛋白H1,H2A,H2B,H3,H4各有一个包含3个或4个氨基酸的序列同源区域．