ATR-Chkl-Cdc25信号通路参与盘基网柄菌G2/M转变期的调控简

显微镜观察盘基网柄菌野生型KAx-3细胞和突变型RNAi-allC细胞,计数结果表明后者的单细胞繁殖速度约为前者的8倍. 为探究该突变型盘基网柄菌细胞周期缩短的原因,用荧光定量PCR和western blot研究了ATR-Chk1-Cdc25信号通路在其中的可能作用. 实验结果表明：RNAi-allC细胞中cdc25基因相对表达量约为KAx-3细胞的8倍,而其Chk1与ATR基因的相对表达量却明显低于KAx-3细胞. 突变细胞中Cdc25蛋白含量高于KAx-3细胞,但其Chk1蛋白含量却显著低于KAx-3细胞. 这些数据表明,两种类型细胞之间的ATR、Chk1、Cdc25在mRNA水平和蛋白表达上均存在差异,特别是ATR基因表达量的不同明显影响ChK1和Cdc25的表达量,提示ATR-Chk1-Cdc25信号通路应该在一定程度上参与了盘基网柄菌细胞周期G2/M期的调控.     

盘基网柄菌发育中尿囊酸酶表达的定量定位研究

用免疫荧光技术对KAx-3多细胞发育不同阶段的尿囊酸酶进行定位观察,用Western blot分析野生型细胞KAx-3 和突变型细胞AK127多细胞发育中尿囊酸酶的表达情况.结果显示：在细胞聚集阶段,尿囊酸酶在盘基网柄菌细胞膜附近存在较多;在细胞丘阶段,尿囊酸酶在细胞丘外层细胞中荧光强度较强;在蛞蝓体阶段,尿囊酸酶在前柄细胞中的表达量明显多于前孢子细胞;在子实体成熟的过程中,在前柄细胞区与前孢子细胞区交界处荧光强度最强,该区域内细胞将分化成前柄细胞B.据此推测尿囊酸酶的定位表达可能与盘基网柄菌细胞分化的类型相关.Western blot结果显示：在KAx-3 发育过程中尿囊酸酶的表达量呈现出逐渐上升的趋势,发育至18 h左右达到最大值;而AK127中尿囊酸酶的表达量始终在低水平徘徊.这表明gp150 的缺失影响了尿囊酸酶的表达.实验结果提示,尿囊酸酶的表达量与发育时间有关,并且这种表达量的变化与gp150存在着密切的关系.     

盘基网柄菌野生型KAx-3和突变型AK127细胞mRNA差异显示分析

为研究gp150蛋白调控盘基网柄菌发育相关基因的功能,用mRNA差异显示技术比较分析盘基网柄菌发育14 h的KAx-3细胞和AK127细胞.结果显示两种类型细胞基因表达有明显差异,突变细胞不能表达275 bp片段.对其测序分析后发现差异片断与编码组氨酸激酶、STATc蛋白及同源框蛋白等的基因中的一段序列有很高的相似性.推测gp150蛋白的缺失引起某些调控因子表达异常,从而使突变细胞的基因表达不正常,最终导致细胞不能完成多细胞发育.     

KAx-3和AK127细胞发育期间的骨架蛋白组分比较研究

采用生化抽提骨架蛋白和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳等方法比较盘基网柄菌AK127细胞和KAx-3细胞骨架蛋白的结果显示,各发育时期的KAx-3和AK127细胞骨架蛋白在含量和组分方面存在一定的差异.在整个发育阶段两种类型细胞共有的蛋白组分是103.4 kD、49.6 kD、44.2 kD、30.8 kD、19.8 kD和13.5 kD条带,其中44.2 kD和30.8 kD是最稳定的细胞骨架成分,并不因AK127细胞缺失gp150分子而有所改变.它们与其他骨架蛋白组分一起为细胞提供有力的支持,保证发育的顺利进行.差别最为明显的蛋白条带是87.2 kD、68.2 kD和40.7 kD蛋白,由于同时期的突变型细胞不能显示这些蛋白条带;说明这些条带是发育所需的蛋白.值得注意的是突变型细胞也出现一条特征性的21.1 kD的蛋白条带.分析认为这些变化一方面与盘基网柄菌发育过程有关,另一方面与突变细胞缺乏gp150分子有密切关系.     

盘基网柄菌allC的克隆、表达和多克隆抗体的制备

运用RT-PCR技术从盘基网柄菌(Dictyostelium discoideum)总mRNA中克隆到了尿囊酸酶基因(allC),该基因编码区开放读框长1 100bp,编码的蛋白约42kD.由于是在野生型和突变型细胞中差异表达的片段,表明该基因在盘基网柄菌多细胞发育中起到重要作用,因此将allC克隆入融合表达载体pET-32a(+),在大肠杆菌E.coliBL21(DE3)中进行诱导表达带有6个组氨酸标签的尿囊酸酶(ALC)融合蛋白,经镍柱亲和层析,获得了电泳纯蛋白.用纯化的融合蛋白免疫新西兰大白兔,制备多克隆抗体.ELISA测得制备的抗ALC蛋白的多克隆抗体的效价可达1∶64 000,Western Blotting检测证明该抗体有较强的针对ALC蛋白的专一性.这些数据表明重组质粒表达的ALC融合蛋白具有良好的抗原性,制备ALC的多克隆抗体有良好特异性和效价,能够满足针对ALC免疫印迹和细胞内定位检测等实验要求,为深入研究ALC蛋白在盘基网柄菌多细胞发育的功能作用提供了有力工具.     

盘基网柄菌(Dictyostelium discoideum)KAX-3和AK127细胞形态发生和同工酶的比较研究

比较了盘基网柄菌(Dictyostelium discoideum)野生型细胞KAx-3和突变型细胞AK127在多细胞发育过程中的形态发生.两者有明显的区别;突变细胞的发育只能停留在细胞疏松聚集阶段,而野生型细胞能顺利完成整个发育过程.利用SDS-PAGE电泳比较分析了两者在重要发育阶段的三种同工酶:醋酶(EST)、苹果酸脱氢酶(MDH)和谷氨酸脱氢酶(GDH).结果发现AK127细胞发育阶段含有两种醋酶成分a和p,而KAX-3细胞中只有一种醋酶a;而且AK127细胞中苹果酸脱氢酶(MDH)含量在发育后14 h和16 h均高于KAX-3细胞;谷氨酸脱氢酶(GDH)同工酶在发育后14 h时相对含量高于KAX-3细胞,而在发育后16 h含量却低于KAX-3细胞.这些数据显示了两种类型细胞的同工酶有明显的差异;表明突变细胞基因的表达发生了一定的改变,由此说明了gp150分子在盘基网柄菌细胞发育中有重要作用.     

KAx-3细胞和AK127细胞发育期间细胞骨架蛋白组分比较研究

采用生化抽提骨架蛋白和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳等方法比较盘基网柄菌AK127细胞和KAx-3细胞骨架蛋白的结果显示，发育各时期的KAX-3和AK127细胞骨架蛋白在含量和组分方面存在一定的差异.在整个发育阶段两种类型细胞共有的蛋白组分是103.4kD、49.6kD、44.2kD、30.8kD、19.8kD和13.5kD条带，其中44.2kD和30.8kD是最稳定的细胞骨架成分，并不因AK127细胞缺失gp150分子而有所改变.它们与其他骨架蛋白组分一起为细胞提供有力的支持，保证发育的顺利进行.差别最为明显的蛋白条带是87.2kD、 68.2kD和40.7kD蛋白，由于同时期的突变型细胞不能显示这些蛋白条带；说明这些条带是发育所需的蛋白.值得注意的是突变型细胞也出现一条特征性的21.1kD的蛋白条带.分析认为这些变化一方面与盘基网柄菌发育过程有关，另一方面与突变细胞缺乏gp150分子有密切关系.     

盘基网柄菌细胞发育中gp150分子与凋亡蛋白作用分析

用Percoll密度梯度技术分离和收集盘基网柄菌前柄和前孢子细胞,Western blot分析gp150分子和胱天蛋白酶在前孢子细胞和前柄细胞两种类型细胞中的表达情况.结果显示：只能在前柄细胞中检测到gp150蛋白条带,并随细胞发育蛋白的量逐渐增加,提示gp150蛋白的表达量与发育时间,前柄细胞分化有密切关系;在前柄细胞中能检测到31.5 kD和37.5 kD分子量大小的凋亡蛋白,且蛋白量也是随发育时间有所增加,在两种类型细胞中都可检测38.2 kD的凋亡蛋白.这些数据表明盘基网柄菌细胞凋亡过程中有类似Caspase-3的蛋白表达,它们的存在与细胞凋亡存在密切关系; gp150分子的表达与胱天蛋白酶的激活可能存在一定关系.     

盘基网柄菌细胞发育中gp150分子与凋亡蛋白作用分析

用Percoll密度梯度技术分离和收集盘基网柄菌前柄和前孢子细胞,Western blot分析gp150分子和胱天蛋白酶在前孢子细胞和前柄细胞两种类型细胞中的表达情况.结果显示：只能在前柄细胞中检测到gp150蛋白条带,并随细胞发育蛋白的量逐渐增加,提示gp150蛋白的表达量与发育时间,前柄细胞分化有密切关系;在前柄细胞中能检测到31.5kD和37.5kD分子量大小的凋亡蛋白,且蛋白量也是随发育时间有所增加,在两种类型细胞中都可检测38.2kD的凋亡蛋白.这些数据表明盘基网柄菌细胞凋亡过程中有类似Caspase-3的蛋白表达,它们的存在与细胞凋亡存在密切关系;gp150分子的表达与胱天蛋白酶的激活可能存在一定关系.     

盘基网柄菌粘附分子gp150的定位及其与PKA活性关系的研究

细胞粘附分子gp150在盘基网柄菌细胞发育后期起着重要作用.用gp150抗体定位gp150在细胞发育重要阶段的分布,显示在细胞发育的不同时段,gp150的定位有着明显的区别.在聚集前的细胞流时期,gp150还均匀分布在细胞质内,到了细胞丘时期,gp150就移至多细胞聚集体的边缘部位.到了蛞蝓体时期,gp150在前柄细胞的表达量明显大于前孢子细胞,提示了gp150对柄细胞的作用.而当细胞发育至子实体阶段,gp150大量分布在成熟孢子的孢壁上,这是目前还没有报道的.高效液相色谱法检测野生型KAx-3细胞和gp150过表达细胞KAx-3:acct15/lagC的PKA活性,显示在细胞发育的早期(10 h之前),PKA在野生型细胞中的活性比KAx-3:act15/lagC细胞低.但是在细胞发育的后期,也就是野生型细胞中gp150开始快速积累之后,PKA在野生型细胞中的活性比KAx-3:act15/lagC细胞高.这些结果说明,gp150和PKA之间可能存在某种负反馈环的关系共同调节盘基网柄菌的生长发育.