人脂联素在大肠杆菌中的可溶性表达

为了提高重组人脂联素在大肠杆菌中的可溶性,构建和表达了增溶标签与人脂联素的融合表达栽体.这些标签包括大肠杆茵硫氧还蛋白和NusA蛋白、酿酒酵母SUMO蛋白和噬热海洋茵Thermotoga maritime 的红素氧还蛋白.结果显示,所有的人脂联素融合蛋白在大肠杆茵中都获得了高水平的表达,但可溶性存在很大差异,说明不同融合标签对人脂联素可溶性表达的促进作用不同.其中,红素氧还蛋白与SUMO蛋白组合一起对人脂联素可溶性的增强作用最为显著,其相应的融合蛋白几乎全部可溶.另外,通过酵母SUMO/Ulp1反应,经His标签亲和层析纯化得到的人脂联素融合蛋白能被有效酶切,加工为人脂联素成熟肽产物.     

绵羊脂联素受体2基因生物信息学分析

采用生物信息学方法对绵羊(兰州大尾羊)AdipoR2基因及其所对应蛋白质进行了分析.结果显示,AdipoR2基因全长1 809 bp,编码386个氨基酸多肽蛋白.核苷酸和氨基酸的同源性与山羊最高,分别为99.1%和99%,非洲爪蟾最低,分别为68.2%和78.5%.兰州大尾羊AdipoR2编码蛋白二级结构中α-螺旋占23.06%,β-片状占27.72%,无规则卷曲占49.22%.ADIPOR2蛋白为跨膜蛋白,N-端位于胞内,C-端位于胞外,由7个跨膜结构域组成.分析表明,绵羊AdipoR2基因由7个外显子和6个内含子组成,核苷酸序列变异以转换为主,转换/颠换比值为2.072.不同物种间绵羊与山羊AdipoR2核苷酸序列间变异最小(0.9%).系统发育分析表明,绵羊与山羊也首先聚为一类,推测绵羊与山羊的分歧时间大约在0.225百万年前.这些结果为进一步分析绵羊脂联素受体2(AdipoR2)基因功能及其所介导的脂联素功能奠定了理论基础.     

脂联素受体与2型糖尿病

脂联素（Adiponectin）是脂肪组织分泌的一种脂肪细胞因子,具有增加脂肪酸氧化、提高葡萄糖摄取量、改善胰岛素抵抗、调控血管内皮的炎症反应等作用。正常人血浆中脂联素浓度与体质量指数（BMI）、腰臀比、空腹血糖、空腹胰岛素、甘油三酯、尿酸和瘦素呈负相关。脂联素还与肥胖、胰岛素抵抗、2型糖尿病和心血管疾病密切相关。     

植物甜蛋白thaumatin基因重组表达质粒的构建

利用NDA重组技术,将植物甜蛋白thaumatin基因克隆至植物表达载体pBI121中,成功地构建了重组植物表达质粒pBI121-th。     

血清脂联素与脑梗死的关系研究

目的研究血清脂联素(APN)水平与脑梗死的关系.方法测定123例脑梗死患者及120名健康对照者的血清脂联素(APN)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)水平、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)和高敏C反应蛋白(hs-CRP)水平,并分析血清脂联素(APN)水平与脑梗死患者神经功能缺损程度评分的相关性.结果脑梗死患者血清脂联素水平明显低于健康对照组(P<0.01).经Logistic回归分析显示:血清脂联素与神经功能缺失呈负相关,血清脂联素和高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)水平降低、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)和高敏C反应蛋白(hs-CRP)升高是脑梗死的危险因素.结论血清低脂联素水平是脑梗死的独立危险因素.     

内蒙古地区2型糖尿病患者危险因素与脂联素基因多态性交互作用研究

目的：探讨内蒙古地区2型糖尿病患者危险因素与脂联素基因rs266729多态性交互作用。 方法：病例组来源于内蒙古医科大学附院以及内蒙古中蒙医院糖尿病患者共111例,对照组来源于内蒙古医科大学附属医院体检中心共106例。运用PCR-RFLP技术检测脂联素（ADIPOQ） 基因rs266729位点多态性。采用二元logistic回归方法分析脂联素基因rs266729多态性与T2DM的相关性,并且与环境因素进行交互作用分析。结果： ADIPOQ 基因rs266729多态性等位基因频率分布符合 Hardy-Weinberg 定律; T2DM基因型频率分布依次为 CC: 85.61% CG : 5.42%GG : 9.02%。校正 BMI之后,CG基因型人群是 CC基因型人群患T2DM的0.260倍,且有显著性意义( p=0.009),而 GG基因型人群是 CC基因型人群患 T2DM的1.146倍, 无显著性意义( P=0.790)。 交互作用分析结果表明： rs266729位点与空腹血糖存在正交互作用;与收缩压、空腹 C肽、空腹胰岛素、生活环境存在负交互作用。结论：脂联素基因 rs266729多态性可以增加个体2型糖尿病罹患风险,且rs266729基因多态性与与空腹血糖、吸烟、酗酒、日常运动、日常情绪、生活紧张度、腰臀比、超重、糖尿病家族史这几项存在正交互作用,与收缩压、空腹 C肽、空腹胰岛素、生活环境存在负交互作用。     

脂联素、IL-32及P-选择素在急性肺损伤大鼠血清及肺组织中的表达

目的分析脂联素、白介素-32(IL-32)和P-选择素在急性肺损伤大鼠模型中的表达情况。方法将40只大鼠,随机分为生理盐水对照组(NS组)和脂多糖急性肺损伤组(LPS组)。LPS组通过注射LPS建立大鼠急性肺损伤动物模型。观察2组大鼠注射后2、6、24和72 h肺组织及血清中脂联素、IL-32和P-选择素指标的变化。结果注射后不同时段LPS组大鼠血清及肺组织中IL-32和P-选择素水平均明显高于NS组(均P <0.05);而LPS组大鼠血清及肺组织中脂联素水平低于NS组(P <0.05)。结论脂联素、IL-32和P-选择素可能参与大鼠急性肺损伤的炎症反应。     

新疆维吾尔族血清脂联素水平分析

为探讨正常新疆维吾尔族血清脂联素水平,分析其与与体重指数、血压、血脂代谢及胰岛素抵抗指数间的相关性,本研究收集无血缘关系的新疆维吾尔族正常人164例血清样本,采用酶联免疫法测定血浆脂联素水平,用放射免疫法测定血清空腹胰岛素(FINS)水平。研究结果表明:维吾尔族血清脂联素水平为(6.89±5.30)μg/mL,男性(6.59±5.78)μg/mL,女性(7.06±5.04)μg/mL,较汉族人群低,性别间脂联素水平的差异有统计学意义(P<0.05)。超重/肥胖组与正常体重组相比血清脂联素水平差异无统计学意义(P>0.05)。血清脂联素水平与体重指数、低密度脂蛋白及空腹胰岛素水平呈显著负相关。这显示:1)新疆维吾尔族血清脂联素水平存在性别差异;2)脂联素水平在肥胖与正常体重组之间无显著性差异;3)血清脂联素与体重指数、空腹胰岛素水平及低密度脂蛋白显著负相关。     

蜂毒素-SP94杂合基因原核表达载体的构建及蛋白纯化

用可以特异结合到肝癌细胞膜上的小肽SP94,与蜂毒素连接,构建重组表达载体pET32a-蜂毒素-SP94.转入大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,SDS-PAGE检测表达结果,产物经Ni-NTA Agrosc亲和层析柱纯化后进行Tricine-SDS-PAGE检测.重组蛋白在大肠杆菌中高效表达,约占细胞总蛋白...     

人穿孔素羧基端肽段的表达纯化与活性鉴定

穿孔素,即成孔蛋白（pore forming protein,PFP),其溶细胞作用与免疫调节和自身免疫病以及其它多种疾病过程中的免疫性病理损伤相关。为得到足够量的PFP建立与之相关的免疫学研究手段用于基础和临床研究,在已克隆人PFP cDNA的基础上,用基因工程方法表达了人PFP C端124个氨基酸肽段（hPFP-C),并通过谷胱甘肽琼脂糖新和层析获得纯化的GST/hPFP-C融合蛋白,经凝血酶酶切和再次北极和层析去除GST部分,得到了纯化的hPFP-C蛋白。纯化的hPFP-C蛋白与兔红细胞共育,呈现钙依赖的溶血活性。     

天花粉蛋白基因的克隆、表达和活性鉴定

用PCR（Polymerase Chain Reaction)扩增出天芬粉蛋白（Trichosanthin,TCS)基因全长序列，插入表达载体，经双酶切鉴定及测序分析，表明阅读框正确，表达His-TCS活性融合蛋白并纯化天花粉蛋白，鉴定出其具有RNA N－糖苷酶活性和抗原抗体结合活性。     

GST-hBLyS融合蛋白基因的构建及其在大肠杆菌中的表达

根据hBLyS (humanBlymphocytestimulator)基因序列设计合成特异性引物 ,用RT_PCR从人外周血淋巴细胞扩增出 85 8bp的hBLyS基因 ,并将其插入到融合蛋白原核表达载体 pGEX_4T_1中 ,得到重组表达质粒pGEX_4T_1/hBLyS。把此重组质粒转化大肠杆菌BL2 1,经用IPTG诱导 ,表达出了GST_hBLyS融合蛋白。     

D-海因酶基因重组子的构建和酶的表达活性

以中华根瘤菌(Sinorhizobium morelense)SS—ori总DNA为模板，用PCR法扩增D-海因酶基因，分别克隆到5种不同的载体，并转入5种不同的Escherichia coli菌株，获得25株工程菌，进行培养与诱导表达．细胞经超声处理后，通过SDS—PAGE和酶活性两种指标比较表达产物．结果表明，除3株工程菌具有D-海因酶活性外，其它均为无酶活性的不溶性包涵体，包涵体经变性、复性后，可部分获得有活性的D-海因酶，其比活为0．90U／mg，复性率约为20％．此外，对包涵体产生的原因及可能解决办法也进行了讨论．     

人源蛋白酪氨酸磷酸酶PTP1B功能域及其全酶的原核表达及活性比较

通过设计引物,利用RT-PCR从人肝癌细胞(huh-7)中克隆蛋白酪氨酸磷酸酶(PTP1B)全长及功能域PTPc的cDNA序列并连接到pGEM-T Vector载体上,测序正确的cDNA序列连接到表达载体pET-32a(+)上,分别在大肠杆菌Transetta(DE3)和BL21(DE3)菌株中稳定表达目标蛋白,经Ni 2+亲和柱纯化后目的蛋白达到了电泳纯,通过酶促动力学方法分析两种蛋白的体外活性.本实验成功表达了PTP1B和PTPc可溶性蛋白,并发现Transetta(DE3)菌株较BL21(DE3)有更高的蛋白表达能力;酶促动力学分析表明,PTP1B全酶的Vmax为16.13mmol·L-1·s-1,Km为0.94mmol/L;其功能域PTPc的Vmax为5.49mmol·L-1·s-1,Km为0.54mmol/L.表明PTP1B全酶的活性高于PTPc功能域的活性.     

人类胰岛素基因的克隆及其真核表达载体的构建

从胎儿胰腺细胞中提取出总RNA作为模板,用特异性引物和RT-PCR法扩增INS基因的cDNA,PCR产物T-A克隆到T载体构建中间重组体pUC57-INS,其测序结果和Genbank公布的序列一致。HindIII和BamHI双酶切pUC57-INS后,将INS基因亚克隆到真核表达载体pEGFP-N1中,经PCR扩增、酶切分析和序列测定后证实了重组表达质粒pEGFP-N1-INS构建成功。这将为转人类胰岛素基因动物模型的建立及人类糖尿病的基因治疗奠定必要的基础。     

大麦黄矮病毒外壳蛋白基因和运动蛋白基因酵母表达载体的构建

根据已知的大麦黄矮病毒GPV株系的外壳蛋白(Coat Protein CP)和移动蛋白(Movement Protein MP)基因序列合成了CP，MP基因的上下游引物，通过PCR扩增获得目的片段，经过Sal I和Rst I酶切、连接、转化、重组质粒的酶切鉴定及基因测序，构建了酵母表达载体pGBKT7-GPV-CP和pGBKT7-GPV-MP，用于在酵母双杂交分析中表达诱饵融合蛋白，为进一步筛选小麦cDNA文库内与大麦黄矮病毒相互作用的寄主因子、克隆寄主因子，推测其种类和功能打下基础。     

人甲状旁腺素的基因表达及活性的初步研究

从人甲状旁腺瘤组织中分离到ｍＲＮＡ,逆转成ｃＤＮＡ后,设计带有突变碱基的引物,通过聚合酶链式反应,扩增ｈＰＴＨ基因,使Ｎ端前５氨基酸的碱基富含腺嘌呤核苷（Ａ）．将该基因克隆到表达载体ＰＥＴＩＣ上,转化大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３）表达,实验证实ｈＰＴＨ的表达量占菌体蛋白总量的１１％;细胞粗步处理产物经腺苷环化酶的生物鉴定实验证实,重组ｈＰＴＨ具有生物活性,粗产物５００倍稀释后,ｈＰＴＨ的放免活性为２０６．５ｎｇ／Ｌ,为对照的４１５倍     

含副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)FlaI基因真核表达重组质粒的构建

用ClaI／EcoRI双切酶切带有副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus)极鞭毛蛋白FlaI基因的质粒p MD18-FlaI，回收目的基因片段，插和到真核细胞表达载体pIRESneo同样经ClaI/EcoRI切开的窗口中，成功地将FlaI克隆到pIRESneo中，获得有意义的重组质粒pIREneo－FlaI,构建的pIREneo－FlaI真核表达重组质粒，将为海水经济鱼类的副溶血弧菌DNA疫苗的研制奠定基础。     

重组人附睾特异蛋白BDFx的优化表达与纯化

通过改变异丙醇-β-D硫代半乳糖苷诱导浓度、诱导温度及诱导培养时间,优化含重组人附睾特异蛋白BDFx工程菌的表达条件．运用DEAE阴离子与CM阳离子交换层析及S-100分子筛层析纯化重组蛋白,用基质辅助激光解吸离子化-飞行时间质谱法、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、紫外扫描等方法鉴定目的蛋白．结果显示,缩短诱导培养时间、降低IPTG浓度等可提高重组蛋白的表达量,表明适当提高诱导表达温度不会形成包涵体,并可缩短表达时间．