酵母双杂交筛选与视黄醇结合蛋白有相互作用的蛋白质

为了研究视黄醇结合蛋白(RBP)在维生素A代谢调控中的作用和与相关疾病发生、发展的关系,以RBP作为诱饵基因构建了融合表达载体pGBKT7-RBP;在排除自身转录激活活性的基础上,与人肾脏cDNA预转库融合筛选(Pretransformed MATCHMAKER Lbraries),经营养缺陷型和X-α-gal显色鉴定,从中筛选出三种与RBP有相互作用的新蛋白质,并从人睾丸cDNA库中克隆了这三个基因的全长序列。     

利用酵母双杂交系统筛选油菜ATP6的相互作用因子

甘蓝型油菜波利马(Brassica napus pol.)细胞质雄性不育系是一种很有实用价值的油菜不育类型.目前关于其分子机制的研究已证实,线粒体ATP合成酶的一个亚基ATP6与其雄性不育相关.本实验以ATP6作为诱饵蛋白,应用酵母双杂交共转化的方法筛选与ATP6相互作用的蛋白质.在获得的阳性克隆中,发现了一个与拟南芥中未知基因AT3G47550所编码的蛋白质具有较高同源性的蛋白质.它含有RING HC的结构,可能在泛素-蛋白质降解途径与细胞质雄性不育间建立起了某种联系.     

酵母双杂交系统筛选与HCMV pUL23蛋白相互作用的蛋白质

将UL23基因的ORF序列克隆到酵母表达载体pGBKT7构建诱饵质粒pGBKT7-UL23,用酵母双杂交技术筛选人胚肾cDNA文库中与人巨细胞病毒pUL23相互作用的宿主蛋白分子,再通过回复酵母双杂交再次确认两者之间的相互作用.结果表明:酵母双杂交,回复酵母双杂交试验证明宿主蛋白分子elF3e(eukaryotic trans-lation initiation factor 3,subunit E interacting protein)能够与人巨细胞病毒UL23蛋白相互作用.宿主蛋白分子elF3e能够与人巨细胞病毒UL23蛋白相互作用,这为进一步研究pUL23蛋白在HCMV生活周期中的作用机制提供依据.     

酵母双杂交技术筛选与Axin相互作用的蛋白质

肿瘤抑制因子Axin以构架蛋白的形式通过Wnt、JNK、p53、TGF-β、G蛋白等众多信号转导途径参与细胞生长、增殖、分化和凋亡等多种重要细胞命运的调控过程.为了发现Axin新的相互作用蛋白,进一步研究Axin的多功能性,作者通过酵母双杂交技术,将Axin1基因从SpeI单一酶切位点到3′末端的DNA序列构建到pGBKT7载体作为诱饵,对小鼠脑的cDNA文库进行筛选,最后获得28个阳性克隆.通过对这些克隆的测序和对所得序列的生物信息学分析,得到13个与Axin的C末端相互作用的蛋白质,这些蛋白主要参与胚胎发育,肿瘤形成,蛋白翻译后修饰等生物学过程的调节.这一结果为进一步研究Axin的新功能提供了很好的线索.     

用酵母双杂交系统筛选与PEN-2蛋白胞内端相互作用的蛋白

γ-分泌酶复合体对β-淀粉蛋白前体蛋白(Beta-amyloid precursor protein,βAPP)的水解是生成β-淀粉蛋白(Aβ)的关键步骤,在阿尔茨海默氏症(Alzhei mer′s disease,AD)的病理发生中起着重要作用.PEN-2蛋白(Presenilin enhancerprotein 2)是γ-分泌酶的一个重要组分,在γ-分泌酶的组装和成熟中扮演重要的角色.此外,PEN-2还具有促进神经细胞存活和防止细胞凋亡的作用.为了进一步研究PEN-2的生理功能,以PEN-2为诱饵蛋白用酵母双杂交系统筛选与之有相互作用的蛋白,发现PCBP4和GRK5肽段可结合PEN-2,并在酵母体系用β-半乳糖苷酶报告基因验证了它们的相互作用.这些结果表明PCBP4和GRK5可能影响PEN-2的正常生理功能,并且有可能在阿尔茨海默氏症的形成中起着一定的作用.     

酵母双杂交筛选PMEPA1互作蛋白

采用酵母双杂交技术筛选与前列腺跨膜蛋白PMEPA1相互作用的蛋白质,构建了pGBKT7-PMEPA1诱饵质粒,获得与PMEPA1互作蛋白,GST pull-down实验确定2种蛋白间的相互作用.构建了诱饵载体转化酵母菌Y2HGold,对酵母宿主无毒性、无自激活活性.得到阳性克隆Dynactin6,GST pull-down实验证实PMEPA1与Dynactin6蛋白间相互作用.推测蛋白Dynactin6可能参与调控PMEPA1在细胞的运输.     

利用酵母双杂交系统筛选甘蓝型油菜ATP6的相互作用蛋白质

通过酵母双杂交系统,以ATP6作为诱饵蛋白筛选与ATP6有相互作用的蛋白质.通过筛选和鉴定,获得了5个与ATP6有相互作用的蛋白质.其中一个与拟南芥中内质网膜上的蛋白转运复合体中的α亚基（Sec61α）有很高的相似性.通过TAIL PCR和设计简并引物扩增初步得到了甘蓝型油菜Sec61α全长基因组序列和cDNA序列.并利用生物信息学分析手段对甘蓝型油菜Sec61α进行了比对和分析,推测该蛋白质可能参与了花粉的发育过程.     

利用酵母双杂交系统筛选与BnSmD1相互作用的蛋白

本研究以油菜BnSmD1为诱饵蛋白,利用酵母双杂交技术,从甘蓝型油菜cDNA文库中筛选出与之有相互作用的Arf-GTP酶激活蛋白1(Brassica napus ADP-ribosylation factor GTPase activating protein1,BnArf GAP1),采用RT-PCR扩增并克隆到3个油菜Arf GAP基因的开放阅读框全长序列,BnArf GAP1、BnArf GAP2和BnArf GAP3.BnArf GAP1和BnArf GAP2都拥有1个507bp的开放阅读框,编码168个氨基酸残基;与前两个基因相比,BnArf GAP3核苷酸序列中插入了一个93bp的带有终止密码子的外源片段,导致翻译的提前终止,它拥有1个249bp的开放阅读框,编码82个氨基酸残基.BnArf GAP1和BnArf GAP2核苷酸序列一致性达到98.22％;BnArfGAP1与BnArf GAP3核苷酸序列一致性达到82.83％,BnArf GAP2与BnArf GAP3核苷酸序列一致性达到84.17％.BnArf GAP1、BnArf GAP2和BnArf GAP3都含有一个C2结构域.     

应用酵母双杂交系统筛选与Spr2相互作用的蛋白

Spr2在斑马鱼胚胎发育过程中的中胚层和外胚层中表达,它可以通过调控Fgf信号通路来调控斑马鱼中胚层的发生.为了进一步揭示Spr2调控Fgf信号通路的分子机制,本文通过酵母双杂交系统在斑马鱼早期胚胎cDNA文库中筛选可能与Spr2相互作用的蛋白,以酵母融合的方法在6.3×106个转化子中筛选到78个阳性克隆,测序鉴定后最终得到Pairedboxgene6a、mSin3A-associatedprotein130等11种可能与Spr2蛋白相互作用的蛋白,通过结果分析推测Spr2可能通过fgf8参与Fgf信号通路的调控.     

用酵母双杂交系统研究铜绿假单胞菌 EtfA 和 EtfB 蛋白的相互作用

EtfA蛋白与EtfB蛋白是铜绿假单胞菌etfA基因和etfB基因编码的蛋白质,分别构成电子传递黄素蛋白的α亚基和β亚基.应用酵母双杂交系统对EtfA和EtfB蛋白之间的相互作用进行研究,发现EtfA与EtfB之间存在较强的蛋白质间相互作用,说明铜绿假单胞菌的电子传递黄素蛋白是以异源二聚体的形式存在于细胞内的;并推测EtfA和EtfB是电子传递链的重要组分,可能为细菌鞭毛的旋转提供能量.     

酵母双杂交筛选与脱落酸受体相互作用的蛋白质及其重转酵母的验证

脱落酸（abscisic acid,ABA）是一种重要的植物激素,它能使植物适应逆境胁迫,从而调节植物的生长发育状况.现今ABA受体已被公认为RCARs/PYR/PYLs家族蛋白.本实验通过拟南芥为模式植物,利用酵母双杂交系统共转化方法从拟南芥cDNA文库中筛选与RCAR3相互作用的蛋白质,获得多个阳性克隆,从中选取一个与生长素调节相关的基因NIT1的全长cDNA重新转化酵母验证,发现与RCAR3仍然有相互作用,排除了假阳性的可能.从而为下一步研究该基因与RCAR3的相互关系做好了准备.     

Screening of the interacting proteins with NifA in <Emphasis Type="Italic">Azospirillum brasilense</Emphasis> Sp7 by the yeast two-hybrid system

NifA in AzospiriUum brasilense plays a key role in regulating the synthesis and activity of nitrogenase in response to ammonia and oxygen available. In this work we used the yeast two-hybrid system to identify the proteins that interact with NifA. The nifA gene was fused to the yeast two-hybrid vector pGBD-C2, and three A. brasilense Sp7 genomic libraries for use in yeast two-hybrid studies were constructed. Screening of the libraries identified four clones encoding proteins that interact with NifA. The confirmation of the interactions of each gene product of the four clones and NifA were carried out by exchanging the vectors for nifA and the four clones and by mutageneses of the four clones with shift reading frame experiments in yeast two-hybrid studies. DNA sequence analyses showed that two clones encode proteins containing PAS domains that play an important role in signal transduction. One clone has high similarity with the fhuE gene of Escherichia coli, whose gene product is involved in iron uptake and transportation, and the other clone encodes an unknown protein.     

应用酵母双杂交系统筛选与NAP1相互作用的蛋白质

用NAP1作为"诱饵"蛋白,通过酵母双杂交系统筛选人淋巴细胞cDNA文库,鉴定阳性克隆;再利用酵母双杂交和免疫共沉淀验证相互作用. 结果表明,通过酵母双杂交系统筛选人淋巴细胞cDNA文库,阳性克隆的鉴定,发现了与NAP1的相互作用蛋白质―蛋白酶体α亚基3(PSMA3). 免疫共沉淀(Co-IP)结果证实外源表达的NAP1蛋白和PSMA3蛋白在293T细胞中有特异性的相互作用. NAP1作为FDC分泌的一种多肽,与PSMA3有特异性的相互作用,这种相互作用如何实现对蛋白酶体降解靶蛋白的活性调节,其作用机理有待深入研究.     

c-Mpl信号转导相关蛋白的结合域确定

血小板生成素（thrombopoietin,TPO）是调节血小板生成最主要的细胞因子，它的生物学效应由其受体c-Mpl介导，为了确定SGK，14-3-3，Siva,Toml,Cop9-S3和c-MplBP等6种蛋白在c-Mpl上的结合区域，构建c-Mpl膜内部分系列缺失片段及点突变，用酵母双杂合的方法检测这些片段与上述6种蛋白的结合情况，发现Box1是c-Mpl与这6种蛋白结合的主要区域，Box1两侧的序列及C端区域对c-Mpl与这6种蛋白的结合也有帮助，将c-Mpl膜内部分的第531位Ser(位于Box1内）突变为Ala和Val后，c-Mpl与SGK,14-3-3，Toml和Cop-S3的结合能力明显下降，提示Ser531可能对c-Mpl与这4种蛋白的结合起重要作用。     

RIG-G基因在酵母双杂交后的蛋白互作验证

RIG－G基因是利用全反式维甲酸（ATRA）诱导，采用差异显示PCR方法从APL细胞系NB4中克隆到的一个新基因。采用酶母双杂交的方法筛到了与RIG－G发生相互作用的JAB1。由于在酵母这种低等真核细胞中缺少诸如高等真核细胞中各种保证蛋白正常生物学功能发挥所必需的翻译后修饰，这种方法筛到的阳性克隆并不一定代表了真实的作用，所以在COS7细胞中采用了CO－IP（co-immunoprecipitation）实验，间接法、直接法均证实了这种相互作用。