发现一个倒位重复DNA序列为结瘤基因转录所必需

豌豆根瘤菌R.leguminosarum中有13个基因参与豌豆根部的结瘤.这些基因统称为结瘤(nod)基因.在这些nod基因中有一个称为nodD的调节基因.nodD至少有2个功能:(1)它的产物NodD蛋白抑制nodD自身的转录,称为自身调控(autoregulation);(2)当有植物分泌的类黄酮存在下,NodD又激活全部其它nod基因的转录.我们的研究发现:(1)除NodD外,     

中国生物固氮研究现状和展望

生物固氮是生命科学中的重大基础研究课题之一, 它在生产实际中发挥着重要作用: 为植物特别是粮食作物提供氮素、提高产量、降低化肥用量和生产成本、减少水土污染和疾病、防治土地荒漠化、建立生态平衡和促进农业可持续发展. 本文在介绍国际生物固氮研究进展的同时, 着重叙述了生物固氮研究取得的重大进展和成果: 收集了根瘤菌资源, 建立了最大的数据库, 修正和发展了国际上对根瘤菌的分类; 发现了固氮基因, 证实了克氏杆菌固氮基因操纵子的连锁性及正调控基因的调节机制和对氧、温度的敏感性; 发现苜蓿根瘤菌结瘤调控基因nodD3的产物对结瘤基因表达的启动不受宿主类黄酮的作用; 发现苜蓿根瘤菌的碳利用基因和固氮生物氮代射和碳代谢基因表达及其调节的偶联作用; 化学合成了根瘤菌的结瘤因子; 在固氮基因表达调节基础上, 构建了固氮基因工程菌株, 并在生产中得到应用; 提出了化学模拟固氮酶的结构和功能, 固氮酶活性中心的模型和合成了模型化合物, 受到了国际高度评价. 根据国际上研究的趋势并结合国内的研究进展, 提出了生物固氮研究的发展方向, 建议在联合(内生)固氮菌固氮基因调控及其提供氮素的作用, 根瘤菌与豆科植物共生结瘤固氮的信号传递和分子相互作用, 氮、碳代谢和固氮与光合作用的偶联与共生结瘤固氮中功能基因组学等方面展开积极研究.     

固氮正调节基因nifA促进大豆根瘤菌的结瘤效率

先前的工作指出nifA不仅调节niffix基因的表达,同时可能也调节包括根瘤形成和维持根瘤功能中的一些基因,通过在大豆根瘤菌Sinorhizobium fredii NH01中引入额外组成型表达的肺炎克氏杆菌（Klebsiella pneumoniae）nifA,研究固氮正调节基因nifA对共生结瘤过程的影响,研究结果发现,引入KpnifA可提高大豆根瘤菌的结瘤活力及竞争结瘤能力,同时初步试验结果证实,带额外nifA的大根瘤菌比野生型大豆根瘤菌具有更高的结瘤因子活性,推测nifA对结瘤过程的促进作用可能作用于根瘤菌的结瘤因子合成阶段,由于结瘤因子是诱导主形成根瘤的主要信号分子,而结瘤过程具有自我调节作用,植株一旦结瘤,就会抑进一步结瘤,因此引入固氮正调节基因nifA能提高结瘤效率。     

Azorhizobium caulinodans ORS571结瘤位点5(nod locus 5)5′端上游DNA片段的诱导型启动子功能

近来年,对根瘤菌结瘤基因启动子的研究十分活跃,已发现在NodD蛋白存在时,结瘤基因启动子受宿主豆科植物分泌的类黄酮类物质诱导,使下游结瘤基因转录.这类启动子在结构上相当保守,大都含有“nod box”.已经报道在Azorhizobium caulinodans ORS571中存在与根瘤菌中nodABC相似的nod     

紫云英根瘤菌nodD基因的克隆及核苷酸序列

豆科植物紫云英(Astragalus sinicus)是生长于我国南方地区的重要绿肥之一.紫云英根瘤菌(Rhizobium huakuii即R.astragali)是革蓝氏阴性细菌,感染豆科植物紫云英后形成有效的固氮根瘤.决定根瘤菌在宿主植物引起根瘤的基因称结瘤基因(nod和nol基因),nod和nol基因的诱变将导致根瘤菌不能或延迟在宿主植物上结瘤.这些基因包括共同结瘤基因nodABC,nodIJ.宿主专一性结瘤基因(hsn)nodEF,nodG,nodH,nodQ等及与结瘤有关的一些nol基     

大豆早期结瘤素基因enod2B启动子在水稻中的表达受结瘤因子诱导

在根瘤菌与宿主豆科植物形成的共生关系中, 根瘤菌分泌的结瘤因子是宿主专一性的主要决定因子. 结瘤因子信号能够诱导豆科植物根毛细胞质膜去极化、离子流动和早期结瘤素基因的表达以及根毛变形、皮层细胞分裂和根瘤原基形成等与共生有关的表型变化. 水稻是重要的粮食作物, 能否对结瘤因子信号产生应答反应是最终实现水稻结瘤固氮的关键因素. 将大豆早期结瘤素基因Gmenod2B的启动子与报告基因b-葡萄糖苷酶(GUS)基因融合构建成嵌合基因Gmenod2BP-GUS, 以此嵌合基因作为探索水稻细胞感受结瘤因子信号的分子标记. 通过根癌农杆菌介导的遗传转化系统, 获得了携带嵌合基因Gmenod2BP-GUS的水稻再生植株. 以广宿主根瘤菌NGR234(pA28)分泌的结瘤因子作为探针, 检测转基因水稻中嵌合基因Gmenod2BP-GUS的表达. 结果表明, 转基因水稻中大豆早期结瘤素基因enod2B启动子的表达可以受结瘤因子诱导, 仅在水稻根部的皮层薄壁细胞和内皮层细胞中呈特异性表达, 并且受到氮源的调控. 推测在水稻中可能存在结瘤因子所诱导的豆科早期结瘤素表达的类似机制.     

豌豆AGAMOUS同源基因功能的初步研究

豌豆是研究植物发育遗传的经典模式植物. 虽然已经克隆到了一些与豌豆花发育有关的基因, 但是由于豌豆基因组大、序列信息少以及缺少有效的遗传转化方法, 豌豆花发育研究的发展受到了限制. 病毒诱导的基因沉默(virus induced gene silencing, VIGS)技术是近年来发展起来的一种反向遗传学快速研究基因功能的方法. 本文利用基于豌豆早褐病毒 (pea early browning virus, PEBV)的VIGS体系研究了豌豆中AGAMOUS同源基因(Pisum sativum AGAMOUS homologous genes, PsAGs)的功能. 在PsAGs沉默之后, 豌豆花表现为雄蕊花瓣化, 心皮开裂, 内生出一朵不完整的花. 半定量RT-PCR分析结果显示, 在沉默植株中PsAGs的mRNA转录水平显著下降. mRNA原位杂交结果显示, 花发育早期, PsAG基因在花原基中央表达, 后期在第三、四轮花器官中表达, 表明在豌豆有多个AGAMOUS同源基因. 实验结果表明, 豌豆中可能存在多个AGAMOUS同源基因, 彼此间功能冗余且相对保守, 同时暗示着在对基因家族成员进行功能研究时, VIGS是有效手段之一.     

结瘤基因群调控蛋白Nod D在DNA分子上的结合位点的测定

豆科植物和根瘤菌协同进行共生固氮,是自然界将游离的N_2转化成有机NH_3的主要途径之一。共生固氮只有在根瘤内环境中才能进行。通过转座突变、重组克隆和转化等一系列实验后发现,共生固氮菌中存在着一群特定的基因——结瘤nod基因,它们引起植物根部结瘤,并决定寄主的专一性。不同根瘤菌内的nod基因数量虽然不同,但一般不超过十多个。     

苜蓿根瘤菌nod C蛋白生化特性的分析

根瘤菌的共同结瘤基因nod A,B和C,具有高度的保守性。这些基因对诱发宿主根毛的卷曲和根瘤早期的形成起重要作用.比较苜蓿根瘤菌(Rhizobium meliloti)和碗豆根瘤菌(R. Leguminosarum)结瘤基因的DNA序列,由此得出nod C蛋白(Nod C)的氨基酸顺序同源性达95％。最近开始对结瘤蛋白生化功能的研究表明,Nod C的结构同细胞表面受体非常类似。     

蒺藜苜蓿重金属转运蛋白HMA5基因在共生结瘤中的功能分析

重金属转运ATP酶(heavy metal transporting ATPase, HMA)主要参与植物体内重金属的转运.前期研究发现,HMA5基因与苜蓿铜胁迫及共生结瘤相关.为探明豆科植物根瘤中的铜离子吸收、转运及平衡机制,本研究以模式豆科植物蒺藜苜蓿(Medicago truncatula, Mt)为材料,对其HMA5同源基因MTR_8g079250在共生结瘤中的功能进行了初步研究.亚细胞定位分析表明, MTR_8g079250主要定位于细胞膜和细胞核上; GFP::MTR_8g079250融合表达分析显示, MTR_8g079250主要在根瘤的分生区、侵染区、皮层和根的中柱、根冠表达, RNAi沉默目的基因后对共生固氮表型没有产生明显影响.然而,目的基因过表达植株的鲜重和单株根瘤数目较野生型明显降低,侵染线和根瘤原基也显著减少;透射电子显微镜分析表明,根瘤细胞中含有少量的类菌体且形状不规则,环类菌体空间增大,呈现出早衰的迹象; q RT-PCR结果显示,结瘤标志性基因NIN、DMI1、ENOD11和豆血红蛋白基因的表达水平均有不同程度的下调,豆血红蛋白基因的表达水平也有所下调.这些结果表明, MTR_8g079250过表达对共生结瘤有抑制作用.     

苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti) nifA基因通过诱导宿主防卫反应调节根瘤的形成

苜蓿中华根瘤菌nifA基因是固氮基因的正调节因子, 本文研究了nifA基因对根瘤形成的调节作用. 在分裂根实验中, nifA突变株对另一侧根的结瘤抑制率比野生型菌下降43.7%, 感染突变株植物合成的植保素和形成的坏死细胞的数量也相应减少, 与植物防卫反应相关的苯丙氨酸解氨酶基因、查儿酮合成酶基因和几丁质酶基因不能表达. 这些结果说明, 苜蓿中华根瘤菌nifA基因通过诱导宿主植物的防卫反应对根瘤的形成进行调节. 虽然nifA突变株在宿主植物上引发根瘤的数量增加, 它合成的结瘤因子的量却比野生型菌株少. 因此, 可以推测nifA基因介导了多种信号途径对根瘤的形成进行调节.     

组成型nifA对大豆根瘤菌(Rhizobium fredii)HN01lux结瘤固氮效率的促进作用

肺炎克氏杆菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）固氮调节基因ｎｉｆＡ对大豆根瘤菌（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｆｒｅｄｉｉ）ＨＮ０１ｌｕｘ的结瘤固氮效率有促进作用。首先构建一个带有Ｋｐ ｎｉｆＡＨ的重组质粒ｐＸＤ１,使ｎｉｆＡ在卡那霉素磷酸转移酶基因启动子控制下呈组成型表达。当质粒ｐＸＤ１转移至大豆根瘤菌ＲｆＨＮ０１ｌｕｘ后,获得带Ｋｐ ｎｉｆＡ的大豆根瘤菌,其结瘤固氮效率与原始出发菌相比有明显     

核蛋白因子与水稻蜡质基因5′端上游顺序的结合

近来,植物基因转录调控的研究借鉴了动物和酵母系统中采用的方法取得了一定进展。如依赖光表达的豌豆rbcS-3A基因,大豆种子发育特异的β-副球蛋白基因和水稻对脱落酸反应的rab基因,在它们表达的那些细胞的核蛋白抽提液中都找到了与其上游顺序特异结     

豌豆乙酰羟酸还原异构酶基因的cDNA克隆及其表达

用cDNA差示分析法从G2豌豆总RNA中筛选到一个GA3特异诱导表达的基因片段,用该片段作探针进一步筛选G2豌豆cDNA文库,得到一个全长2036bp的cDNA序列。经分析,该cDNA含有一个1746bp的可读框,编码的蛋白质含有581个氨基酸,理论分子量为64ku,cDNA及推导的氨基酸序列分别与不同来源的乙酰羟酸还原异构酶相应序列有较高的同源性。将该基因转入表达载体中并在大肠杆菌中表达,获得了具有显著酶活性的外源蛋白。     

紫云英参与共生固氮的2个新结瘤素基因的分离与鉴定

通过抑制差减杂交, 比较了接种华癸中生根瘤菌(Mesorhizobium huakuii) 7653R的紫云英(Astragalus sinicus)的根与未接种根瘤菌的对照根在转录水平上的差异, 建立了紫云英共生结瘤过程中的差异表达基因文库, 并在此基础上证实了2个结瘤特异性基因AsⅡC259和AsG2511. 其可读框显示, AsⅡC259和AsG2511编码的多肽链长度分别为134和58个氨基酸, 其氨基端均含有一个信号肽. 结构域查询结果揭示, AsⅡC259编码的多肽链包含了2个N-糖基化位点、一个依赖于cAMP的蛋白激酶(PKA)和cGMP依赖的蛋白激酶(PKG)磷酸化位点以及一个酪蛋白激酶Ⅱ(CK2)磷酸化位点. BlastP同源搜索表明, AsⅡC259多肽链仅与一个来自羽扇豆(Lupinus luteus)根瘤的新结瘤素蛋白表现出较低的同源性. 对于AsG2511多肽链, 没有发现任何明显的同源序列. Virtual Northern blot和半定量RT-PCR分析表明, AsⅡC259和 AsG2511均只在接种根中表达, 说明它们确为结瘤特异性基因; 另外, 这2个基因的表达比豆血红蛋白基因晚2~4 d, 应为晚期结瘤素基因.     

禾本科/豆科间作促进豆科共生固氮机理研究进展

综述以往研究发现,大多数禾本科/豆科间作都会显著增加豆科作物的固氮比例(%Ndfa),并认为这种增加是由于禾本科作物对豆科作物根际氮素的耗竭作用引发的.但豆科作物体内通常会在氮磷之间保持稳定的化学计量关系,豆科作物共生固氮的增加会使作物生长受到磷的限制.在这种磷素限制条件下豆科作物会被激发出潜在的磷吸收策略,即通过根系分泌物或丛枝菌根真菌增加对土壤磷素的获取满足其自身固氮对磷素的大量需求,进而增强豆科作物自身的结瘤及固氮.此外,随着分子生物学技术的发展,新近研究发现禾本科作物根系分泌物能上调豆科根部关键结瘤基因NODL4, ENODL2, ENOD93,固氮基因FixI3,查尔酮-黄酮异构酶CFI基因和生长素响应基因GH3.1的表达,这些基因超量表达可促进豆科作物类黄酮物质的分泌、根毛卷曲、结瘤并促进豆科作物固氮.间作作物间通过根际氮素耗竭作用、磷素活化作用以及固氮基因分子调控等三个层面上互相偶联来促进间作系统氮素吸收、优化氮素利用效率和提升作物产量,这些研究对促进和发展禾本科/豆科间作固氮理论体系具有重要指导意义.     

组成型nifA对大豆根瘤菌(Rhizobium fredii))HN01lux结瘤固氮效率的促进作用

肺炎克氏杆菌(Klebsiella pneumoniae)固氮调节基因nifA对大豆根瘤菌(Rhizobium fredii)HN01lux的结瘤固氮效率有促进作用.首先构建一个带有Kp nifA的重组质粒pXD1,使nifA在卡那霉素磷酸转移酶基因启动子控制下呈组成型表达.当质粒pXD1转移至大豆根瘤菌RfHN01lux后,获得带Kp nifA的大豆根瘤菌,其结瘤固氮效率与原始出发菌相比有明显提高,感染大豆幼苗后,大豆生物量的增加,如植株株高、植株鲜重、植株干重及大豆产量均优于原始出发菌.     

紫云英根瘤菌基因文库的构建和结瘤基因片段的分离

根瘤菌(Rhizobium)与寄主豆科植物的共生涉及到根瘤菌和植物之间的识别;根瘤菌的浸染;根瘤的形成;根瘤菌类菌体的发育等一系列复杂的过程。 在苜蓿根瘤菌(R. meliloti)中决定引起根瘤的结瘤基因(nod gene),目前已经鉴定出nodA,B,C,D。因为这类基因在多种根瘤菌中都被找到,而且在功能上可以互补,所以     

共生固氮体系中最佳固氮结瘤控制模型

共生固氮体系是用以探明核酸与蛋白质之间相互关系的极好研究对象。对该体系中固氮结瘤过程的了解和控制,可望使原来不结根瘤的禾本科等经济作物也能结瘤固氮。“共生固氮体系中最佳固氮结瘤控制模型的研究”这一国家基础性研究重大关键项目,在我固有着坚实的基础,更有着美好的前景。     

一套新的遗传密码——DNA的知识正发生根本的变化

130年前,当格雷戈尔·孟德尔(GregorMendel)在教堂外的花园中散步时,他并不满足于让花鸟虫鱼自生自灭。这位奥地利的神父小心地将红花的花粉洒在白花的柱头上,又将结皱缩豆粒的豌豆植株与结饱满豆粒的豌豆植株杂交。然后让这些开白花或红花,结豆饱满或皱缩的植株白交,从中孟德尔发现了生物遗传的规律。他的结论很简单,而且现在看来似乎也还是正确的:后代从他的父母那里各获得23条染色体,有一些基因(比如蓝眼基因)是隐性的,而另一