EB1蛋白在调节微管动态、纺锤体定位和染色体稳定性中的作用

EB1(the end-binding protein 1)蛋白家族是一群广泛存在且高度保守的微管相关蛋白,存在于从酵母到人类的广泛的生物体中.它与微管正极和中心体结合,参与了绝大部分基于微管的生理过程,包括:维持细胞极性,调节染色体稳定性,有丝分裂纺锤体的定位,将微管锚定到成核位点.自从1995年,Su等人在人细胞中发现了EB1基因,各种生物体中EB1的同源物质被相继报道.十年来,人们通过对不同生物体的研究,试图揭开EB1在细胞中的分布以及它的生理功能.然而到目前为止,对于EB1的了解还非常有限.本文结合国外的研究成果,对EB1蛋白在调节微管动态、纺锤体定位和染色体的稳定性方面以及它与APC(the adenomatous polyposis coli)之间的相互作用作以综述.     

动力蛋白轻链亚基LC8在人细胞内的亚细胞定位

动力蛋白是活跃于微管骨架上行使负向运输功能的分子马达.从人类B淋巴细胞cDNA文库中克隆得到动力蛋白轻链亚基的基因LC8,将该基因插入表达绿色荧光蛋白的载体pEGFP-C3,获得的重组DNA成功在两种人源细胞内表达.通过荧光实验对GFP-LC8亚细胞定位进行分析,确定GFP-LC8是典型细胞浆定位,主要分布在细胞外周区和微管组织中心附近.当用药物nocodazole处理细胞使微管解聚时,GFP-LC8的定位发生改变.表明融合蛋白可正确指示LC8的细胞定位,可用于进一步研究病毒感染后的胞内事件.     

纤毛虫阔口游仆虫皮层微管胞器的形态及形态发生

采用荧光紫杉醇直接荧光标记,研究了腹毛类纤毛虫阔口游仆虫(Euplotes eurystomus)中由纤毛器、纤毛器附属微管和非纤毛器微管组成的皮层微管胞器.其中纤毛器、纤毛器附属微管包括口围带及小膜托架微管,波动膜及基部微管骨架网,额腹横棘毛、左缘棘毛及基部的前纵维管束、后纵微管束和横微管束,背触毛及基部的玫瑰花环附属微管等;非纤毛器皮层微管包括背腹面的细小网格状微管,背面的斜向微管层及贯穿于细胞纵长的纵微管层等.形态发生中,老口围带被前仔虫继承,前、后仔虫的额腹横棘毛发生及分化过程中老纤毛器基部微管退化,并且老棘毛及其附属微管可能具有定位和定向作用,但未见直接的物质联系.所得结果为揭示腹毛目纤毛虫皮层微管胞器建构的多样性、细胞皮层微管的分化及其细胞调控提供了基础资料.     

华美游仆虫皮层细胞骨架的超微结构及免疫电镜观察

 应用透射和免疫电镜术,在超微结构水平观察显示,腹毛类纤毛虫华美游仆虫的皮层纤毛器和非纤毛器细胞骨架中,表膜下、细胞质深部的微管或纤维束,以及纤毛器及纤毛器附属微管等均是以α-和 β-微管蛋白为主要成分的微管类结构;中心蛋白定位于纤毛器的基体腔、基体基部近中心端、基体基部近中心端连接及基体中部连接结构中,而在纤毛杆和皮层非纤毛器微管中无中心蛋白成分存在。据此认为,该纤毛虫中,基体部位的蛋白组成机制与纤毛杆及纤毛器附属结构是不同的,非分裂期细胞中定位于基体主体部位的中心蛋白可能与维持相关结构的稳定性有关。     

γ—微管蛋白：微管蛋白超家族的新成员

γ微管蛋白存在于所有的真核生物中,是一种非常保守的蛋白质,可能由多基因编码。γ微管蛋白通常位于微管的负端,是微管组织中心的组成成分,对微管的装配、微管的取向等起着很重要的作用,文中介绍γ微管蛋白的发现、序列分析及其比较、在细胞内的含量和定位、结构和功能模型、以及多基因家族等方面的研究新进展。     

驱动蛋白分子Kif14细胞内中小体定位的研究

为了探讨决定人体驱动蛋白分子Kif14在细胞有丝分裂末期时定位于细胞中小体的功能域,构建了驱动蛋白分子Kif14各功能域的绿色荧光蛋白(GFP)真核细胞表达质粒,分别转染于人体子宫颈癌细胞He La中.应用聚丙烯酰氨凝胶电泳和免疫印迹法(Western Blot)检测各蛋白的表达情况;应用免疫荧光染色法(immunofluorescence)分别对微管蛋白(Tubulin)、着丝粒相关蛋白(CREST)和DNA染色,荧光显微镜下观察各绿色荧光融合蛋白在有丝分裂末期的亚细胞定位.结果发现,细胞有丝分裂末期,驱动蛋白分子Kif14的N末端GFP融合蛋白定位于中小体(midbody),马达区GFP融合蛋白沿微管分布,杆状尾区GFP融合蛋白以点状分布于细胞质,尾区GFP融合蛋白分布于整个细胞中.由此认为,Kif14驱动蛋白分子的N末端延伸区决定该蛋白分子在细胞有丝分裂末期定位于中小体.     

人源fidgetin like-1蛋白AAA结构域的重组表达及酶学性质分析

Fidgetin是2000年发现的一个AAA蛋白家族新成员,同源序列分析表明它与ka-tanin、spastin属于AAA家族的同一亚家族,因此可能也具有ATP依赖的微管切割活性,ATP的结合和水解应该发生于fidgetin蛋白中保守的AAA结构域.在大肠杆菌中重组表达的人源fidgetin like-1(FIGL-1)蛋白的AAA结构域片段(HsFIGL-1-AAA),纯化后的最终产率为每升5 mg蛋白.与AAA蛋白通常形成六聚体不同,HsFIGL-1-AAA在溶液中为单体,且其ATPase活性很低,仅为0.0063 s-1.与其他AAA蛋白的序列比对发现,Sensor 2 motif中保守的Arg残基在HsFIGL-1-AAA结构域中为Thr,但该位点的突变T609R并未明显改变该蛋白的ATPase活性.这些结果提示HsFIGL-1可能以一种特殊的方式发挥功能,这为进一步研究fidgetin及其同源蛋白的结构和功能奠定了基础.     

新基因NtTKR及其同源物LeTKR的生物信息学分析

驱动蛋白是一类与微管结合的ATPase,在细胞内执行着多种功能.序列对比分析表明,烟草不同发育时期胚cDNA文库的差异筛选分离到的在叶和发育各时期胚中优势表达的驱动蛋白家族新成员NtTKR与番茄驱动蛋白LeTKR(AF242356.1)高度同源.运用生物信息学方法对二者编码产物的同源性、功能结构域特点和可能的翻译后修饰等进行了比较分析,结合目前已知的实验结果预测了该基因可能参与的生物学过程.这些分析和预测将对进一步实验证实NtTKR在烟草的形态发生及胚胎发生中的提供有益的指导.     

TMCO1蛋白2种不同亚型的表达分析

内质网钙离子通道蛋白TMCO1具有2个不同的亚型,分别表达239个氨基酸和188个氨基酸,而2种亚型在细胞中的表达还缺少研究论证.通过对氨基酸序列的分析,比较了2种不同亚型的结构域,并构建得到2种不同亚型的哺乳动物细胞表达载体.免疫荧光实验和蛋白质免疫印迹实验表明了2种蛋白亚型的亚细胞定位和表达,同时表明在哺乳动物细胞中,TMCO1的m RNA更倾向于在下游的起始密码子翻译.进一步通过RNA干扰实验发现敲低TMCO1的表达对细胞周期没有明显的影响.     

朱顶红成熟花粉萌发过程中生殖细胞微管变化的超微结构观察

应用透射电镜对朱顶红花粉水合、活化和萌发过程中的超微结构尤其是生殖细胞微管的结构形式和分布格局的变化进行了详细的观察.在成熟花粉时期,椭圆形生殖细胞中的微管组成纵向束平行于细胞的长轴分布并靠近质膜,微管间无结构上的联系.花粉活化时,生殖细胞形状不断变化,微管的数量显著减少,多为单一微管具各种方向分布.花粉萌发后,进入花粉管中的生殖细胞为纺锤状,具多个裂瓣,微管的结构形式和分布方式与成熟花粉时期的相似,即微管组成纵向束,充满裂瓣.但微管间及微管与质膜间以横桥相互连接.     

核定位蛋白的结构域特征分析

蛋白质的结构决定蛋白质的功能,结构域(domain)是蛋白质序列中具有独立功能的区域,而发挥功能的区域在结构上通常是保守的.根据Swiss-Prot建立亚核定位蛋白数据集,分为6个亚核区域共1505条蛋白质序列,对该数据集中的核蛋白进行结构域的搜索与功能的分析,通过提取细胞核内6种亚核定位蛋白含有的结构域信息,找到了染色体、核仁和核膜区域蛋白质的独特的结构域以及6种亚核定位蛋白共有的结构域,这些结构域特征信息可用于进一步预测蛋白质的亚核定位.     

水稻中两个同源异型结构域转录因子的亚细胞定位

为了对水稻同源异型结构域转录因子HD-ZipⅢ家族中的HDZ1和HDZ2进行亚细胞定位,利用RT-PCR技术从水稻cDNA中扩增HDZ1和HDZ2的编码区(去除终止密码子序列),与绿色荧光蛋白GFP编码框融合,构建2个转录因子的瞬时表达载体,采用农杆菌介导的转化方法转化至烟草中进行瞬时表达分析.结果表明:PCR扩增所得为目的基因片段HDZ1和HDZ2;二者与载体质粒pCAMBIA35S-GFP连接获得的融合表达载体成功移至烟草中并表达;确定HDZ1主要定位于烟草叶片的气孔中,而HDZ2定位于烟草表皮细胞的细胞膜上.二者在亚细胞中的定位不同,可能在水稻生长发育中所起的作用也不相同.     

3BP2中SH2结构域的晶体结构及其与来源于FRS2α的肽的复合物

提出了一个3BP2的Src同源区2结构域(SH2)不同于其他SH2结构域的全新肽链结合模式,它与FRS2来源的多肽结合于不同的氨基酸残基. 实际上,该SH2结构域与该短肽的三个重要残基相结合形成完美的几何互补,通过BioCore实验验证,这三个氨基酸最好是Y-E-N.     

3BP2中SH2结构域的晶体结构及其与来源于FRS2α的肽的复合物晶体结构研究

提出了一个3BP2的Src同源区2结构域(SH2)不同于其他SH2结构域的全新肽链结合模式,它与FRS2来源的多肽结合于不同的氨基酸残基. 实际上,该SH2结构域与该短肽的三个重要残基相结合形成完美的几何互补,通过BioCore实验验证,这三个氨基酸最好是Y-E-N.     

热处理对HeLa细胞微管影响的研究

目的:用HeLa细胞作模型,研究热处理对肿瘤细胞微管的影响.方法:用不同温度(37°C、、40°C43°C和45°C)经不同时间(1h和2h)水浴处理培养的HeLa细胞后,分别即时用SABC法显示其微管.结果:与37°C相比,40°C处理后的HeLa细胞微管变化不大,43°C处理后,微管开始解聚,并随着作用时间的延长而加剧,45°C处理2h,微管组织中心消失.结论:高温能引起HeLa细胞微管呈现渐进式的解聚变化,微管组织中心具有较强的保护作用.     

拟南芥AtRAC在盐胁迫应答中的功能研究

本实验所研究的拟南芥AtRAC含有两个RING结构域和三个蛋白激酶C保守区域1结构域即C1结构域.通过体外泛素化证明了AtRAC具有E3连接酶活性,亚细胞定位实验结果表明AtRAC定位在细胞核中.组织特异性分析表明AtRAC在根中的表达量很高,但是在茎、叶和花中的表达量较低,而且AtRAC的表达受到NaCl胁迫的诱导.进一步对atrac突变体的分析表明,在NaCl处理下,突变体atrac的萌发率降低,侧根数目也降低.初步研究表明拟南芥AtRAC可能是一个与盐胁迫应答相关的基因.     

神经细胞树突中mRNA的运输

将mRNA靶定到神经细胞树突中, 对区域化蛋白质合成和神经功能的发挥起重要作用。神经细胞mRNA存在于包含不同种类调控mRNA 定位、稳定和翻译组分的颗粒中。该颗粒由驱动蛋白1(kinesin 1) 沿微管运输。定向运输产生的mRNA不对称分布是突触可塑性、学习和记忆所必需的。     

包囊游仆虫包囊形成和解脱过程中微管蛋白基因表达的变化

采用干涉相差显微术和实时荧光定量PCR(Q-PCR)技术显示,腹毛类纤毛虫包囊游仆虫(Euplotes encysticus)包囊形成和解脱过程中,细胞微管胞器始终处于非装配及装配的功能活动状态,脱包囊过程中伸缩泡的运动对细胞充分吸水用于微管胞器的再装配及细胞运动起了关键的作用,细胞内α-、β-和γ-微管蛋白基因的表达量相伴发生变化.其中,微管胞器去分化时,细胞形成毛基体非吸收型包囊,细胞α-、β-和γ-微管蛋白基因的表达量整体呈现逐渐减少的趋势,其细胞微管蛋白基因的相对表达量从大到小依次是β-、α-和γ-微管蛋白基因,但α-、β-微管蛋白基因的起始拷贝数远大于后一种微管蛋白基因的表达量;微管胞器再分化时,伴随着伸缩泡的剧烈伸缩运动,口纤毛器和体纤毛器微管先后形成,细胞在包囊内做旋转运动并脱囊而出,迅速转化为营养细胞,期间细胞内α-、β-和γ-微管蛋白基因的表达量呈现从小到大增加的趋势,其微管蛋白基因的相对表达量从大到小依次是β-、α-和γ-微管蛋白基因,而前两种微管蛋白基因的起始拷贝数远大于后一种微管蛋白基因的表达量.结果表明,包囊游仆虫形成包囊和脱包囊过程中,伴随着皮层微管胞器的不同分化,细胞内α-、β-和γ-微管蛋白基因始终处于不同的功能活动状态,其中作为微管组织中心主要组分的γ-微管蛋白也始终处于不同的功能状态.     

蛋白质结构域划分方法及在线服务综述

蛋白质结构域是研究蛋白质结构、功能与进化的基本单位,不同的结构域可组合出更为复杂的蛋白质分子.划分蛋白质结构域后,可以从结构域的角度研究蛋白质的结构、功能与进化,降低了研究复杂度.根据已知结构的蛋白质统计,有约40%的为多结构域蛋白质,其中还存在一级结构上不临近的氨基酸序列出现在同一个结构域的情况,即不连续结构域.文章给出了当前国内外有关蛋白质结构域边界预测、不连续结构域检测及结构域数据库与在线服务的研究进展,供相关研究者参考.     

人源fidgetin like-1蛋白AAA结构域的重组表达及酶学性质分

Fidgetin是2000年发现的一个AAA蛋白家族新成员,同源序列分 析表明它与ka-tanin、spastin属于AAA家族的同一亚家族,因此可能 也具有ATP依赖的微管切割活性,ATP的结合和水解应该发生于 fidgetin蛋白中保守的AAA结构域.在大肠杆菌中重组表达的人源 fidgetin like-1(FIGL-1)蛋白的AAA结构域片段(HsFIGL-1-AAA),纯 化后的最终产率为每升5 mg蛋白.与AAA蛋白通常形成六聚体不 同,HsFIGL-1-AAA在溶液中为单体,且其