绵羊β-乳球蛋白基因调控序列的分离、克隆及序列分析

根据绵羊β－乳球蛋白基因调控区ＤＮＡ序列设计了两个引物，以绵羊基因组ＤＮＡ为模板，用ＰＣＲ技术扩增，得约９００ｈＰ的ＤＮＡ片段插入到ｐＵＣ１８质粒的ＸｂａＩ／ＫｐｎＩ位点之间．ＰＣＲ产物的克隆经双酶切、ＰＣＲ检测和序列分析证明是绵羊β－乳球蛋白基因的调控序列．序列分析结果表明该克隆片段与绵羊β－乳球蛋白基因相应ＤＮＡ序列相比有很高的一致性．研究结果为指导异源基因的表达和进一步利用乳腺特异表达的转基因动物生产医用蛋白提供了有效的调控序列．     

斜纹夜蛾NPVp74基因的克隆及部分序列分析

以含ｐ７４基因的ＡｃＮＰＶＥｃｏＲⅠ－Ｐ片段作探针,与ＳｌＮＰＶ基因组在非严格条件下进行Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交,将ＳｌＮＰＶｐ７４基因定位于４９００ｂｐ的ＳｌＮＰＶＸｈｏⅠ－Ｐ片段．对ＳｌＮＰＶＸｈｏⅠ－Ｐ片段中的一段９４０ｂｐ的ＤＮＡ片段进行序列测定,通过ｉｎｔｅｒｎｅｔ经ＢＬＡＳＴ与Ｇｅｎ－Ｂａｎｋ中的ｄａｔａｂａｓｅ比较分析发现,序列中的一段２４３ｎｔ序列与ＡｃＮＰＶｐ７４基因有６０％的同源性,一段８１ｎｔ序列与ＡｃＮＰＶｐ７４基因的同源性高达７９％．与ＣｆＮＰＶｐ７４相比,２段２６４ｎｔ和１００ｎｔ序列分别有６０％和７１％的同源性．测得序列中的部分序列与ＢｍＮＰＶ、ＯｐＮＰＶｐ７４基因也有高达５８％～７８％的同源性．同时,这部分序列编码的氨基酸与ＡｃＮＰＶ及ＯｐＮＰＶＰ７４蛋白的氨基酸序列也有很高的同源性．结果表明所测序列的一部分为ＳｌＮＰＶＰ７４蛋白Ｃ－端的编码序列．     

多能硫杆菌RubisCO基因（rbcL－rbcS）的克隆及限制性内切酶图谱分析

以光合细菌圆球状红杆菌Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒｓｐｈａｅｒｏｉｏｄｅｓ的ｒｂｃＬ－ｒｂｃＳ基因为探针，与多能硫杆菌（Ｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓｖｅｒｓｕｔｕｓ）染色体ＤＮＡ酶切谱带进行Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交，检测到了ｒｂｃＬ－ｒｂｃＳ基因的同源序列，又以ｐＵＣ９为载体，克隆了Ｔ．ｖｅｒｓｕｔｕｓ染色体ＤＮＡＰｓｔＩ酶切片段，构建成Ｔ．ｖｅｒｓｕｔｕｓ基因文库，并从这个基因文库中筛选到了含有ＲｕｂｉｓＣＯ基因的重组质粒，将其命名为ｐＳＤＬＳ－１０，进一步对ｐＳＤＬＳ－１０进行了限制性酶切分析，作出了ｐＳＤＬＳ－１０限制性内切酶图谱     

Ran结合蛋白RanBP1的同源基因M3的克隆与功能分析

以Ｒａｎ结合蛋白ＲａｎＢＰ１的保守区域作为探针,低严谨条件下杂交筛人视网膜ｃＤＮＡ文库,得到阳性克隆Ｍ３,它与鼠ｚｈｘ－１基因高度同源。ＲＨ作图将其定位于８ｑ２４．１￣ｑ２４．３。拼接ＥＳＴ序列并填补缺口,得到Ｍ３ ｃＤＮＡ全长４９３４ｂｐ,与Ｎｏｒｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ得到的主要转录本长度一致。此ｃＤＮＡ全序列包括２６２２ｂｐ开放阅读框,编码８７３氨基酸,含有２种翻译调控元件ｕＵＡＧ和ＴＴＡＴＴＴ     

绵羊β—乳球蛋白基因调空序的分离,克隆及序列分析

根据绵羊β－乳球蛋白基因调控区ＤＮＡ序列设计了两个引物，以绵羊基因组ＤＮＡ为模板，用ＰＣＲ技术扩增，得约９００ｂｐ的ＤＮＡ片段插入到ｐＵＣ１８质粒的ＸｂａＩ／ＫｐｎＩ位点之间。     

致弱I型MDV pp38基因同源物的克隆和序列分析

将致弱Ｉ型马立克病病毒（ＭＤＶ）感染的细胞基因组ＤＮＡ的ＥｃｏＲＩ酶切产物建于ｐＵＣ１８质粒载体文库中,以ｄｉｇｏｘｉｎｇｅｎｉｎ标记的含有中毒ＧＡ株ＭＤＶｐｐ３８基因克隆片段作为探针,进行了原位杂交反应,初步筛选出阳性重组质粒,进一步用ＥｃＲＩ酶切分析筛选到含ｐｐ３８基因同源物的重组ｐＵＣ１８质粒,序列人析表明该ｐｐ３８基因同源物与ｐｐ３８基因有极高的同源性,仅有１个碱基突变并导致１个氨基酸的夫     

Bc1-2 基因加强表达对 OA 诱发的细胞编程死亡的效应

ＯＡ能诱发人神经母细胞瘤ＳＫ细胞进行编程死亡．死亡细胞缩小变圆，细胞质凝聚，ＤＮＡ有控降解成约２００ｂｐ左右的片段，且这一过程可由蛋白质合成抑制剂亚胺环己酮（ＣＨＸ）抑制．将编码Ｂｃ１－２全长蛋白质的ｃＤＮＡ植入ｐＸＪ４１ｎｅｏ载体中，使其表达由ＨＣＭＶ病毒启动子控制．形成的顺义（ｐＢｃｌ－２－Ｓ）及反义（ｐＢｃｌ－２－ＡＳ）表达质粒经转染导入ＳＫ细胞中获得稳定转染子，Ｗｅｓｔ－ｅｒｎ印迹表明顺义转染子表达较大量的２６ｋｄＢｃ１－２蛋白，而反义转染子则不表达．增强表达的Ｂｃ１－２基因产物对ＯＡ引ＳＫ细胞编程死亡无抑制效应．     

形成多角体家蚕重组病毒通用转移载体构建

从家蚕核型多角体病毒（ＢｍＮＰＶ）通用转称载体ｐＢＫ２８３和粉纹夜蛾核型多角体病毒（ＴｎＮＰＶ）转移载体ｐＳＸＩＶＶＩ＋Ｘ３系列出发，构建了一个７．２ｋｂ能形成多角体且可以用于克隆含不同读码框外源基因的ＢｍＮＰＶ通用转移载体系列ｐＢＭＸ３．ｐＢＭＸ３系列以ＢｍＮＰＶ多角体结构基因上游的１．９ｋｂ和下游１．３ｋｂ的片段作为与ＢｍＮＰＶ基因组进行体内同源重组的同源序列；ｐＳＸＩＶＶＩ＋Ｘ３系列的ＳＸＩＶ双启动子用于外源基因的表达；ＡｃＮＰＶ的多角体基因作为重组病毒形成多角体的基因．以ＢｍＮＰＶ－ＬａｃＺ（ｏｃｃ－ｇａｌ＋）为出发株病毒，ｐＢＭＸ３系列的重组病毒筛选有ｏｃｃ＋和ｇａｌ－两个遗传标记     

斜纹夜蛾核多角体病毒egt基因的克隆和部分序列分析

用ＡｃＭＮＰＶｅｇｔ基因中的保守区部分片段为探针,通过Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交确定ＳｌＭＮ－ＰＶｅｇｔ基因的位置在ＰｓｔⅠ４９７０ｂｐ和ＸｂａⅠ２６００ｂｐ的片段上．采用双链ＤＮＡ序列分析方法测序,在２６００ｂｐ片段上的ＥｃｏＲⅠ位点两侧得到５９４ｂｐＤＮＡ碱基序列,用计算机ＤＮＡＳＩＳ和ＰＲＯＳＩＳ软件,将５９４ｂｐＤＮＡ碱基序列所推测的氨基酸序列与ＡｃＭＮＰＶ和ＳｌｉＭＮＰＶ的ｅｇｔ基因氨基酸序列进行同源比较,其同源性分别为４５％和８６．５％．     

AcNPV增强子hr5增强HBsAg基因表达的研究

用形成包涵体（ＯＯＣ＋）并能利用人工合成启动序列和多角体ＸＩＶ启动子表达外源基因的转移载体质粒ｐＳＸＩＶＶＩ＋Ｘ３将多角体基因、乙型肝炎病毒表面抗原（ＨＢＳＡｇ）基因和苜蓿丫纹夜蛾核型多角体病毒（ＡｃＮＰＶ）的增强子ｈｒ５部分序列同时插入无包涵体的粉纹夜蛾核型多角体病毒ＴｎＮＰＶ－ＳＶＩ－Ｇ基因组中，得到两株高效表达ＨＢｓＡｇ基因又形成包涵体的重组病毒ＴｎＮＰＶ－ｓｈｒ３５－ＯＣＣ＋和ＴｎＮＰＶ－ｓｈｒ２６－ＯＣＣ＋．对重组病毒的酶切鉴定、ＤＮＡ斑点杂交和Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ分析证实，外源基因及其相应的启动子和增强子序列已正确插入病毒基因组中．插入顺序中，ｈｒ５增强子是插入ＨＢｓＡｇ基因下游，多角体基因与ＨＢｓＡｇ基因方向相反．１２５Ⅰ－固相放射免疫检测和Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ结果表明，ＨＢｓＡｇ基因在昆虫离体细胞中得到高效表达并保留了抗原活性．ＴｎＮＰＶ－ｓｈｒ２６－ＯＣＣ＋和ＴｎＮＰＶ－ｓｈｒ３５－ＯＣＣ＋表达的ＨＢｓＡ吕蛋白与没有插入增强子序列的重组病毒ＴｎＮＰＶ—ＨＢｓ８５－ＯＣＣ＋的比较，分别提高了４０％和４６％．     

小白菜苏云金牙孢杆菌CryIB基因的遗传转化

用限制ＳｐｈＩ和ＥｃｏＲＩ消化质粒ｐＢＹＴＥＳｐ１０１－１和ｐＢＱＸ,将ｐＢＱＸ上的经发行过的苏云金芽直菌杀虫晶体蛋白基因ＣｒｙＩＢ取代ｐＢＹＴＥＳｐ１０１－１上的ＧＵＳ基因,得到一个中间克隆ｐＢＩＷＩＱ－１。用限制酶ＨｉｎｄⅢ消化质粒ｐＢＩＷＩＱ－１,回收含ＣｒｙＩＢ基因的５．１ｋｂＤＮＡ乍段,插入质粒ｐＢＩＮ１９的Ｈｉｎｄ０２８３位点,构建成具卡那霉素抗性的植物表达载体ｐＢＩＷＩＱ－５．ＥＴ     

大肠杆菌β－半乳糖苷酶基因在小菜蛾细胞中的表达

用携带大肠杆菌β－半乳糖苷酶（β－ｇａｌ）基因的杆状病毒转移载体．ｐＡｃ３６０－β－ｇａｌ与苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒（ＡｃＮＰＶ）ＤＮＡ经钙磷沉淀法共转染小菜蛾细胞系（ＢＣＩＲＬ－ＰＸ２－ＨＮＵ２,Ｐｘ）,利用Ｘ－ｇａｌ空斑检测分析,β－ｇａｌ基因成功地插入ＡｃＮＰＶ基因组中,得到重组病毒Ａｃ－β－ｇａｌ,重组病毒在Ｐｘ细胞中表达出受ＡｃＮＰＶ多角体蛋白基因启动子控制的具有生物活性的外源基因表达产物──β－ｇａｌ．     

人肿瘤细胞株中细小病毒H—1的DNA扩增与非结构蛋白NS—1基因的表达

研究三株人癌细胞和两株对照细胞对细小病毒Ｈ－１杀伤作用敏感性的分子机制．表明了在感染复数ｍｏｉ（ｍｕｌｔｉｐｉｃｉｔｙｏｆｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）为５ｐｆｕ（ｐｌａｑｕｅｆｏｒｍｉｎｇｕｎｉｔ）／细胞的情况下，作为Ｈ—１病毒复制受纳细胞的人肝癌细胞株ＯＧＹ－７７０３和人胃癌细胞株ＳＧＣ—７９０１，能够支持病毒ＤＮＡ扩增和非结构蛋白ＮＳ—１基因的表达，这和作为阳性对照的由ＳＶ４０转化的新生儿肾细胞株ＮＢ—Ｋ一样，但对Ｈ—１病毒感染有抗性的人肾癌细胞株ＯＵＲ—１０和它的对照人胎肾细胞株ＨｕＫ—１，并不支持病毒ＤＮＡ扩增和ＮＳ—１蛋白的表达．本文结果指出，细小病毒Ｈ—１的杀伤作用与细胞中的病毒ＤＮＡ扩增及ＮＳ—１基因表达的程度相关．     

牛α—s1酪蛋白基因3‘端DNA的PCR扩增,克隆及鉴定

本研究以牛血总ＤＮＡ为模板，用ＰＣＲ技术扩增牛α－ｓ１酪蛋白基因的５＇端３．６ｋｂＤＮＡ片段和３＇端１．５ｋｂＤＮＡ片段的调控区序列，得到了相应的特异性扩增片段．用Ｋｌｅｎｏｗ处理后，将两个扩增片段分别与经Ｓｍａｌ酶切的ｐＵＣ１８质粒载体用Ｔ４ＤＮＡ连接酶连接，转化大肠杆菌ＪＭ１０９．在含有Ｘ－ｇａｌ，ＩＰＴＧ和Ａｍｐ的选择培养基上培养．从白色菌落中提取质粒ＤＮＡ，进行限制酶切鉴定．结果得到一个插入有１．３ｋｂＤＮＡ片段的阳性克隆．对其进行部分序列分析表明，该片段为５＇端缺失约１７０ｂｐ的牛α－ｓ１酪蛋白基因３＇端及下游区序列．     

日本脑炎病毒（JEV）内蒙古分离株M73—1E基因的5′端？…

根据国外报道的ＪＥＶ（Ｊａｐａｎｅｓｅ ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ）基因组全序列,针对ＪＥＶ Ｅ基因５′端设计合成一对特异引物,以日本脑炎病毒内蒙古分离株Ｍ７３－１ＲＮＡ为模板,经ＲＴ－ＰＣＲ扩增,获得３６６ｂｐ的ＪＥＶ Ｅ基因ｃＤＮＡ片段。将此片段重组于质粒ｐＵＣ１９中,并转化大肠杆菌ＤＨ５α,经ＰＣＲ扩增,酶切及序列分析,结果表明ＪＥＶ Ｍ７３－１ ５′端１２６个核苷酸序列与ＪＥＶ日     

环状芽胞杆菌（Bacillus circulans）基因表达效率调节DNA片段的研究

用大肠杆菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）启动子探针型载体ｐＳＵＰＶ１从环状芽胞杆菌（Ｅａｃｉｌｌｕａｅｉｒｃｕｌａｎｓｃ－２）基因组中分离的启动子片段ＢＣ６能使无启动子的卡那霉素抗性基因恢复活性，并在大肠杆菌中获得高效表达（卡那霉素抗性高达１２００μｇ／ｍＬ）．当用限制酶ＸｂａⅠ去除其５′－端１．２ｋｂ片段（命名为Ｘｂ片段）后，３′－端片段仍能启动Ｋａｎ￣ｒ基因表达，其抗性水平降至４００μｇ／ｍＬ但当１．２ｋｂ片段反向插回原有位置时，其抗性水平降至６００μｇ／ｍＬ．将Ｘｂ片段正向插入另一重组质粒ｐＢＣ３中融合的Ｋａｎ￣ｒ基因启动子的上游时，卡那霉素抗性由２００μｇ／ｍＬ上升至１０００μｇ／ｍＬ．当Ｘｂ片段反向插入时，Ｋａｎ￣ｒ基因的表达却明显受到抑制，降为１００μｇ／ｍＬ．这说明Ｘｂ片段具有正向增强而反向衰减Ｋａｎ￣ｒ基因表达的能力．用ＢＣ６片段的两个亚克隆片段与ｃ－２菌株总ＤＮＡ分别作Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交时，结果显示３′－端片段以单拷贝形式存在于基因组中，而Ｘｂ片段则以多拷贝形式散布其中．由此推断Ｘｂ片段并非一定伴随该基因启动子存在．     

基因拷贝数分析的研究

基因拷贝数分析的研究王瑛（中国科学院动物研究所，北京，１０００８０）陈来同（北京大学生命科学学院，北京，１００８７１）关键词基因拷贝数；单倍体基因组；α１－抗胰蛋白酶基因；大鼠ＲＡＬＲＳ－１重复序列中图分类号Ｑ５７８基因拷贝数（ｃｏｐｙｎｕｍｂｅｒ）...     

斜纹夜蛾NPV多角体基因的克隆和部分测序

本文对ＳＩＮＰＶ基因组作了酶解分析，测得其基因组大小为１４５ｋｂ，并用双酶法确定了ＳＩＮＰＶ基因组的ＨｉｎｄⅢ和ＰｓｔⅠ物理图谱。以含ＡｃＮＰＶ多角体基因的质粒ｐＡＣ－Ⅰ的ＳａｌＩ－Ｃ片段为探针，对ＳＩＮＰＶＤＮＡ酶切片段ｓｏｕｔｈｅｒｎ转印杂交结果，初步判断多角体基因定位于ＰｓｔＩ－Ｂ／Ｃ／Ｄ片段、ＢｇｌⅡ－Ｃ／Ｄ片段、ＢａｍＨＩ－Ｂ／Ｃ片段和ＥｃｏＲＩ－Ａ／Ｂ片段上，且ＳＩＮＰＶ与ＡｃＮＰＶ多角体蛋白基因有６４％的同源性，而以大肠仟菌质粒ｐＵＣ１９为载体对ＳＩＮＰＶ的多角体基因试克隆，得到带有ＢｇｌⅡ－ＰｓｔⅠ双酶切片段的２个克隆子。对这两个杂交阳性克隆子之一的核苷酸序列测定，表明插入片段与ＢｍＮＰＶ多角体基因上游序列亦有一定同源性。     

犬c-yes原癌基因

利用Ｓｏｕｔｈｅｎ ｂｌｏｔ和ＤＮＡ碱基序列分析技术，对正常犬ｃ－ｙｅｓ原癌基因的颁布规律及ｃ－ｙｅｓ ｃＤＮＡ的结构进行了分析。结果表明。犬体细胞染色质中ｃ－ｙｅｓ基因均一分布，ｃ－ｙｅｓ ｃＤＮＡ开放阅读框架有５３９个氨基酸组成，分子量为６０，３６８Ｄａ，与人和鸡ｐ６１＾ｃ－ｙｅｓ同源性分别为９５．９％和９０．４％。该产物具有ｓｒｃ（ＳＨ）３，ＳＨ２同源区和酷氨酸激酶序列，该序列与人和鸡的同源     

人胰岛素原乳腺表达载体的构建

通过ＰＣＲ方法扩增了人胰岛素（ＨＩ）基因１．３４ｋｂ的ＤＮＡ片段并克隆于ｐＵＣ１８的ＳｍａⅠ位点内。经ＤＮＡ序列分析表明，该片段为ＨＩ基因的氨基酸编码区及３＇端调控区序列。同时，应用ＰＣＲ方法对牛α－乳白蛋白（ＢαＬＡ）基因进行了扩增，得到了０．８４ｋｂＤＮＡ扩增片段。将其克隆于去除了ＥｃｏＲＩ位点的ｐＵＣ１８ＳｍａＩ位点内，经内切酶分析和ＤＮＡ测序证明该片段是ＢαＬＡ基因５＇调控区序列。ＥｃｏＲ