大肠杆菌中插入表达信号肽提高吡咯喹啉醌产量的研究

本文将载体pET-22b的信号肽基因pelb插入pET-28a-pqq的T7启动子和pqq基因之间,得到重组工程菌E.coli-BL21(pET-28a-pelb-pqq),发酵生产吡咯喹啉醌（PQQ）。结果表明PQQ最高产量可达40.73mg/L,比对照菌E.coli-BL21(pET-28a-pqq)提高了24.36%。此外,工程菌和对照菌前3h发酵的单位菌体产量及单位菌体产率均较高,且此后呈下降趋势。而E.coli-BL21(pET-28a-pelb-pqq)在21h后的PQQ产量及生物量均增加,推测PQQ产量与菌体生物量之间存在同促关系。     

依赖新辅基PQQ甲醇脱氢酶的研究

生长在甲醇作唯一碳源的甲基营养菌（Ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｉｃｂａｃｔｅｒｉａ）Ｎｏ．２细胞,经超声波破碎,缓 冲液抽提,ＤＥＡＥ－和ＣＭ－纤维素柱层析等纯化步骤,可得到纯化的甲醇脱氢酶,其比活力为５．７ｕ／ｍｇ。     

吡咯喹啉醌生产菌的发酵条件优化

对一株产吡咯喹啉醌(PQQ)假单胞杆菌Pseudomonas 0813的发酵条件进行了优化,通过单因素试验确定碳源、氮源及无机盐成分,之后用正交试验法优化各成分配比,考察了发酵温度、初始pH值和转速对该菌产PQQ的影响。结果表明,最优的培养基配方为：酵母粉5g/mL、蛋白胨1g/mL、KH₂PO₄ 0.5g/mL;最适的发酵条件为：发酵温度30℃、初始pH 6.5、发酵转速150r/min。在此条件下,Pseudomonas0813菌株在250mL体系摇瓶发酵中的PQQ产量为448mg/L,在1.5L体系发酵罐扩大培养后的最高产量可达 695.mg/L,这是目前报道未经优化或基因改造菌株的较高产量。     

肺炎克雷伯杆菌表达吡咯喹啉醌依赖性聚乙烯醇脱氢酶

聚乙烯醇脱氢酶（PVADH）是降解聚乙烯醇（PVA）的关键酶,大肠杆菌或毕赤酵母生产PVADH需额外添加辅酶吡咯喹啉醌（PQQ）才具活性。为了降低添加PQQ的成本,在PQQ天然生产菌肺炎克雷伯杆菌（Klebsiella pneumoniae）中表达全酶PQQ-PVADH。首先通过外源基因密码子优化实现PVADH的高效表达,PVADH酶活达到45 U/mL;进而通过辅酶再生提高PQQ产量,双质粒重组菌Kp（pvadh+pqq）的PVADH酶活达到68 U/mL;最后经发酵优化,PVADH酶活达到81 U/mL,为PQQ-PVADH的生产提供了另一种选择方案。     

甲醇利用型细菌发酵生产吡咯喹啉醌的培养条件

以甲醇为唯一碳源,对生丝微菌TH205进行培养,研究了甲醇流加速度、Fe^2 浓度对细胞生长及吡咯喹啉醌(PQQ)表达量的影响。结果表明：培养基中添加浓度为7μg／mL的Fe^2 ,并控制甲醇的流加速度使培养基中甲醇浓度为1mL／L时,细胞的生长情况较好,且此时PQQ的发酵产量为26．6μg／mL。     

基于全局转录工程促进肺炎克雷伯氏菌吡咯喹啉醌的生物合成

用易错PCR构建肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)RNA聚合酶rpoD基因的突变文库,将其与载体连接后转化肺炎克雷伯氏菌,从1500个阳性克隆中筛选出一株吡咯喹啉醌(PQQ)生产菌。发酵试验表明,该工程菌的PQQ产量为76mg/mL,比携带未突变rpoD基因的对照菌提高了10%。测序发现rpoD基因在核酸和蛋白质水平的突变率分别达到2.5%和0.5%。二级结构预测发现α螺旋、β转角和无规则卷曲数目均发生了变化,推测由此改变了σ因子与启动子的亲和程度,从而导致了PQQ基因的转录以及K. pneumoniae代谢流量再分配,使得PQQ得到更高效表达。     

大肠杆菌葡萄糖脱氢酶基因的克隆与原核表达

克隆出大肠杆菌编码葡萄糖脱氢酶(PQQGDH)的 gcd 基因,构建了诱导型表达载体pET28a-gcd,转化大肠杆菌E. coli BL21后获得阳性克隆菌株BL21/pET28a-gcd。IPTG诱导后,经SDS-PAGE分析表明,该工程菌PQQGDH的表达量约为对照菌的18倍,约为18.2 mg/L,实现了高表达。此外,研究发现添加MgCl₂能提高PQQGDH的表达量。     

三（8—羟基喹啉）合铝的合成和光物理行为

合成了三（８－羟基喹啉）合铝（Ａｌ（Ｏｘ）３）晶体化合物，产率９３．６％。测定了Ａｌ（Ｏｘ）３的物理化学常数和光物理常数。Ａｌ（Ｏｘ）３在芳烃溶剂中荧光量子效率φｆ较低，在非芳烃溶剂中，φｆ和荧光寿命随溶剂的粘度增加而升高，计算了辐射失活速率常数的非辐射失活速率常数（ｋｎｒ），φｆ的升高与ｋｎｒ降低相关，比较了Ａｌ（Ｏｘ）３在不同相态介质中的荧光行为。     

三（8－羟基喹啉）合铝的合成和光物理行为

合成了三（８－羟基喹啉）合铝（Ａｌ（Ｏｘ）＿３）晶体化合物，产率９３．６％。测定了Ａｌ（Ｏｘ）＿３的物理化学常数和光物理常数，Ａｌ（Ｏｘ）＿３在芳烃溶剂中荧光量子效率较低，在非芳烃溶剂中，和荧光寿命随溶剂的粘度增加而升高。计算了辐射失活速率常数和非辐射失活速率常数的升高与ｋ＿（ｎｒ）降低相关，比较了Ａｌ（Ｏｘ）＿３在不同相态介质中的荧光行为。     

8—羟基喹啉合十钒酸盐的研究（Ⅶ）钙（Ⅱ）盐的合成,鉴定与性质

8—羟基喹啉合十钒酸盐的锂、钠、钾和铵盐曾有过报导。由于都为碱金属的盐类,很多方面具有相似性,这里,我们合成了这类特殊配合物的钙盐,对比后发现,钙盐与前面报导过的碱金属盐类有很大的差别,如溶解度和配合物中配体的内外界数目等等,这一类配合物是结构复杂及分子量巨大的特殊类型的配合物,由于它们本身的性质和对酸碱的敏感性等方面,希望我们这一工作能对钒及某些元素的分离会有所帮助。实验部分 (一) 主要试剂和仪器五氧化二钒(分析纯);氢氧化钙(分析纯);8—羟基喹啉(分析纯);丙酮(分析纯)。     

含吡咯亚胺铁（II）配合物的合成、表征及晶体结构：位阻效应对配位形式的影响

合成两种含吡咯亚胺铁(Ⅱ)配合物Fe[(2-C4H3N(CH=NR]2(1)和Fe[(2-t-Bu-5-C4H3N(CH=NR]2(2)(R=2-MeOPh),并进行元素分析、红外光谱、核磁共振以及X-射线衍射表征.结构分析表明,这两种配合物都含有两个吡咯亚胺配体,但位阻效应对配位形式的影响明显,其中配合物1中的金属铁离子与4个氮原子以及1个氧原子配位,形成五配位的变形平面锥体构型,而配合物2则是由金属铁离子与4个氮原子配位形成变形的四面体结构.     

银（Ⅰ）、铊（Ⅰ）、汞（Ⅰ）、锶（Ⅱ）和钡（Ⅱ）盐的合成与表征──8－羟基喹啉合十钒酸盐的研究（Ⅴ）

合成了银（Ⅰ）、铊（Ⅰ）、汞（Ⅰ）、锶（Ⅱ）和钡（Ⅱ）的８－羟基喹啉合十钒酸盐，并通过元素分析、ＩＲ、Ｘ射线衍射及热分析等方法探讨了配合物的性质。     

反-环己二醇二（吡咯-2-）羧酸酯的合成与晶体结构

合成了反式环己二醇二（吡咯-2-）羧酸酯,利用X-射线单晶衍射技术在室温下测定了该化合物的晶体结构。结果表明,标题化合物处于单斜晶系,C2／c空间群,晶胞参数为：α=1．8327（18）nm,b=0．8553（9）nm,c=1．0122（10）nm,a=γ=90°,β=106．037（12）°,V=1．525（3）nm^3,Z=4。在晶体结构中,环己烷部分采用了椅式构像,同时标题化舍物是G对称的;整个分子通过N—H…O氢键形成一维柱状结构,在C-H…π弱相互作用的帮助下进一步形成二维层状结构;化合物的红外光谱也进一步表明分子间存在N-H…0氢键相互作用。     

吡咯喹啉醌施用浓度和方式对辣椒生长及土壤理化性质的影响

为探明吡咯喹啉醌对辣椒生长及土壤理化性质的影响,通过盆栽辣椒研究不同吡咯喹啉醌施用浓度和方式对土壤理化性质(土壤容重、土壤孔隙度、速效氮、速效磷和速效钾)、土壤微生物(真菌、细菌、放线菌及微生物总量)活性及辣椒生长(植物学性状、产质量及根系活力)的影响.结果表明:施用吡咯喹啉醌对土壤容重、土壤孔隙度、土壤真菌数量、放线菌数量、土壤速效氮含量、土壤速效钾含量及辣椒果实中的Vc含量和可溶性蛋白含量无显著性影响或无影响,但可提高土壤细菌数量和微生物总量,增加土壤中有效磷含量,促进辣椒的生长,增加辣椒果实单果重和单株重,提高辣椒根系活力,增加辣椒果实中可溶性糖含量;其中灌根处理对土壤细菌数量、微生物总量及土壤有效磷的增加优于喷施处理,而喷施处理对辣椒生长及产质量的提高优于灌根处理.在辣椒实际生产中,灌根和喷施配合施用500 nmol·L~(-1)吡咯喹啉醌,能改善土壤和促进辣椒生长.